基于网络药理学的血必净治疗H1N1病毒引起的肺微血管渗漏的潜在机制

韩甜甜 李丹华 刘小虹 詹少峰 江勇

摘要 目的：探讨血必净注射液干预肺微血管渗漏辅助治疗H1N1病毒性肺炎的潜在药理作用机制。方法：收集血必净注射液中的活性成分，反向预测潜在作用靶点。从GeneCards数据库中获得疾病相关靶点。使用Venny工具对药物及疾病的潜在靶点进行交集分析，并对交集靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建。利用DAVID和京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库进行通路注释，采用Cytoscape软件构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络模型。结果：共筛选出25个活性分子，通过调控TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN等关键基因，影响核因子κB信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡信号转导途径、血管内皮生长因子信号通路和Toll样受体信号转导途径等91条通路发挥抗炎、调节免疫等作用。结论：本研究明确了血必净注射液抗炎和调节免疫作用的物质基础，为进一步阐释血必净注射液干预肺微血管渗漏辅助治疗H1N1病毒性肺炎相关机制提供科学依据。

关键词 血必净注射液;H1N1病毒;肺微血管渗漏;内皮细胞;潜在机制;内皮屏障;网络药理学;病毒性肺炎

Abstract Objective：To explore the potential pharmacological mechanism of Xuebijing injection in the intervention of pulmonary microvascular leakage in the adjuvant treatment of H1N1 viral pneumonia.Methods：Active ingredients in Xuebijing injection were collected，and the potential targets were prediected.Disease-related targets were obtained from the Genecards database.The Venny tool was used to analyze the intersection of potential targets of drugs and diseases，and a PPI network for the intersection targets was constructed.DAVID and KEGG databases were retrieved for pathway annotation，using Cytoscape software to construct a network model of “Chinese medicine-active ingredients-targets-disease”.Results：A total of 25 active molecules were screened out，which can regulate key genes of TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3 and JUN to affect 91 pathways，including the NF-κB signaling pathway，HIF-1 signaling pathway，and TTR，apoptosis signaling pathway，vascular endothelial growth factor signaling pathway，and Toll-like receptor signaling pathway，with anti-inflammatory and immune regulation functions.Conclusion：This study clarifies the material basis of Xuebijing injection′s anti-inflammatory and immune regulation effects，and provides a scientific basis for further elucidating the mechanism of Xuebijing injection′s intervention in pulmonary microvascular leakage adjuvant treatment of H1N1 viral pneumonia.

Keywords Xuebijing injection; H1N1; Pulmonary microvascular leakage; Endothelial cells; Potential mechanism; Endothelial barrier; Network pharmacology; Viral pneumonia

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.006

自1918年西班牙流感大流行以来，流感病毒感染一直是全球健康关注的问题[1]。2009年由一种新型的甲型H1N1流感病毒引起“墨西哥流感大流行”，波及全球214个国家和地区，死亡人数超过290 000人，其中201 000人死于呼吸衰竭[2]。H1N1病毒扩散到下呼吸道，则会导致病毒性肺炎，进而可发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）以及急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI），即肺微血管渗漏增加导致肺水肿、低氧血症和呼吸衰竭的综合征[3]。现代研究表明，肺内皮屏障功能的丧失是ARDS和ALI中形成肺水肿等的关键因素。而H1N1病毒可以对肺内皮细胞产生直接和间接的影响，激活和诱导内皮使肺内皮屏障功能障碍，从而导致微血管泄漏。这些发现增加了增强肺内皮屏障完整性或调节肺内皮激活，可能被证明对严重流感具有治疗作用的可能性[4-5]。防治肺微血管渗漏可作为重症流感的治疗靶标。

血必净注射液是由丹参、红花、川芎、赤芍、当归组成的复方制剂，具有活血化瘀、清热凉血、溃散毒邪的作用[6-7]。现代医学研究证明，其具有降低炎症介质水平、调节免疫、抗氧化应激反应、降低血管内皮细胞损害以及改善微循环等作用。对辅助治疗重症肺炎具有良好的临床疗效[8-10]。

因复方中药物成分繁杂庞大，且其多成分、多靶点、散弹式综合治疗的特点使得传统的围绕单体进行有效成分筛选的工作难以实现[11]。随着学科交叉和创新思路的发展，网络药理学的提出与应用，从整体和分子水平为研究中药提供了新的且可行的理论和方法。其从网络生物学角度，在理解“疾病-靶点-药物”相互作用网络的基础上，通过计算、分析、建模方法，来观察药物对药理网络的干预与影响[12-14]。因此运用网络药理学对血必净活性成分进行鉴定与筛选，活性成分靶标确认和药理学分子机制研究更切合中药的实际情况。探索血必净注射液干预肺微血管渗漏辅助治疗H1N1病毒性肺炎的物质基础和作用机制，为临床应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 收集活性成分 利用中国期刊全文数据库（CJFD）、中国学术期刊数据库（CSPD）、中文科技期刊数据库（CCD），通过检索“血必净注射液有效成分”关键词，收集血必净注射液中活性成分，从CAS数据库中确定活性成分的化学结构，再通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，下载该活性成分的2D结构图，利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库反向预测对应的靶点。

1.2 肺微血管渗漏相关靶点的筛选及其与血必净注射液共有潜在靶点的筛选 以“Pulmonary Microvascular Leakage Caused by H1N1”作为关键词，在GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库进行检索及筛选。通过Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），获得血必净活性成分靶点与疾病靶点的交集，并通过Cytoscape 3.7.1软件构建活性成分-靶点-疾病网络图。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建以及关键功能团筛选 利用STRING平台（https：//string-db.org/）构建蛋白質-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络，再利用Cytoscape 3.7.1软件对结果进行网络拓扑属性分析并筛选关键功能团。

1.4 富集分析 通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）数据库对上述预测得到的关键靶点信息进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（https：//www.genome.jp/kegg/，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到相关生物学及通路信息。根据KEGG网站上的通路信息及相关文献，对通路进行解释。

2 结果

2.1 活性成分的筛选 共收集血必净注射液活性成分25个。见表1。

2.2 中药-活性成分-靶点-疾病网络 根据SwissTargetPrediction数据库中的对应靶点共搜索出25个相关化学成分对应的674个相关靶点，从GeneCards数据库中得到疾病相关的靶点107个，通过Venny软件，取得疾病与活性成分相关靶点基因交集，得到37个交集基因。见图1。通过Cytoscape 3.7.1构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络。见图2。该网络图由37个基因、25个药物活性成分、1中药物和1种疾病组成，而每条边则表示化合物与靶点之间的相互作用关系。该图体现出一个药物包括多种活性成分，一种成分可以对应多个靶点，反过来一个靶点也可以对应多种成分，直观地表明中药复方多成分、多靶点的特点。根据度值排序，咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸A在网络中的关联度较高。

2.3 PPI网络及核心功能团 为了更直观地了解血必净注射液干预血管渗漏的作用机制，明确靶点和靶点间作用关系。将37个交集基因输入到STRING数据库进行分析，物种选择“Homo sapiens”，网络中共包含37个节点，346条边，平均节点度值18.7的网络图。节点表示靶标蛋白，边表示蛋白与蛋白相互作用关系。见图3。导出TSV格式文件，信息导入Cytoscape 3.7.1软件绘制核心靶点网络图，并对网络进行分析。见图4中TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN度值显著高于其他靶点，在PPI网络中起十分重要的作用。

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析 对37个交集基因进行分子功能（Molecular Function），生物过程（Biological Process）、细胞组成（Cellular Component）以及信号通路进行相关分析及注解，获得91条相关信号通路。利用DAVID数据库中的功能注释工具对37个交集靶点靶点进行GO富集分析，根据P<0.05获得靶点基因的生物学过程、细胞组分和分子功能共1 570条信息。其中生物过程（BP）条目1 444个，细胞组分（CC）条目40个，分子功能（MF）条目86个。见图6。生物过程主要涉及凋亡反应、药物反应等，细胞组成主要涉及细胞膜、细胞外空间等方面，分子功能主要涉及蛋白结合、相似蛋白结合、蛋白磷酸酶结合等方面。共筛选出排名前6位的GO条目。见图5，表2。对筛选出的潜在靶点蛋白进行KEGG通路富集分析，共获得（P<0.05）获得91重要通路，主要在影响核因子κB信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡信号转导途径、血管内皮生长因子信号通路和Toll样受体信号转导途径中富集。根据P值从大到小选取前30条通路。见图6。

3 讨论

内皮细胞是肺内最丰富的细胞类型，占细胞总数的30%。在肺泡中，内皮细胞排列在形成肺泡壁网络的毛细血管上。在内皮细胞的顶端，内皮细胞与循环血液直接接触，并形成吸收的炎症细胞的附着部位[15]。内皮细胞经适当活化后，表達细胞黏附分子，黏附分子与白细胞上的同源配体结合，介导白细胞外渗。在基底外侧，内皮细胞位于基底膜上，基底膜与上皮基底膜紧密相连（甚至与上皮基底膜融合）[16]。这种亲密接触表明内皮细胞受到来自肺泡腔上皮细胞和炎症细胞释放的信号和病毒颗粒的强烈影响。通过这些信号和病毒颗粒激活内皮细胞是介导对甲型流感有效免疫反应的关键。然而，内皮细胞的活化可能在内皮屏障的损伤中起一定作用，并导致肺水肿[17]。

流感病毒诱导肺内皮致血管通透性增加有多种机制，主要为以下3种：1）流感病毒可感染内皮细胞，诱导内皮细胞死亡，从而损伤内皮屏障;2）诱导内皮细胞产生过量的细胞因子，一方面能够直接损伤内皮细胞，另一方面会招募嗜中性粒细胞和巨噬细胞诱导内皮屏障损伤[18];3）流感病毒感染诱导产生的细胞因子和其他炎症介质导致细胞骨架重塑，内皮细胞与细胞之间连接的破坏，同时也可导致黏附分子的上调，从而促进白细胞的募集[19]。

本研究借助网络药理学的方法探讨了血必净注射液分别通过抗炎，调节血管内皮凋亡途径达到治疗由H1N1病毒引起肺微血管渗漏的药理作用机制。研究结果提示血必净注射液可能作用于TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN等关键基因发挥作用的，分析中药-活性成分-靶点-疾病网络图发现，咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸A等化合物在网络中的关联度较高。进一步GO和KEGG富集分析表明37个潜在靶点与核因子κB信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡信号转导途径、血管内皮生长因子信号通路和Toll样受体信号转导途径相关。提示血必净注射液可能通过这些通路起到治疗作用。

流感病毒感染的治疗通常是以支持治疗为主。大多数感染病毒的患者会出现典型的流感症状，并在一周内完全康复，不需要抗病毒治疗[20]。患有严重疾病或呼吸道症状较轻的患者，应使用神经氨酸酶（NA）抑制剂：多数情况下使用奥司他韦，在奥司他韦不可用的情况下则采用雾化扎纳米韦或静脉内注射帕西韦进行治疗[21]。在严重疾病的情况下，可以考虑使用更大剂量的奥司他韦和更长的治疗时间。包括肺保护通气和NA抑制剂在内的支持性措施是治疗严重流感导致呼吸衰竭和ARDS的主要手段。然而在研究治疗策略时，重要的是要考虑在感染病毒致更严重的病毒性肺炎甚至是出现严重肺损伤之前，对患者进行干预、增强肺内皮屏障完整性或调节肺内皮激活治疗。因此，防治肺微血管渗漏可作为重症流感的治疗靶标[22-23]。

综上所述，应用网络药理学方法对血必净注射液的活性成分、潜在靶点、潜在通路进行了分析，从分子水平阐述了血必净注射液对机体进行调控的过程，为血必净注射液干预肺微血管渗漏辅助治疗流感病毒性肺炎提供了理论依据。当然，没有通过具体的实验验证，因此存在一定的局限性，有待进一步通过相关研究加以证实。

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（2020-11-19收稿 责任编辑：魏庆双）