基于网络药理学的小青龙汤治疗变应性鼻炎作用机制探讨

钟常英 李欣宇 徐慧贤

摘要 目的：通过网络药理学方法探讨小青龙汤治疗变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）的作用机制。方法：运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获得小青龙汤的活性成分及作用靶点，在疾病靶点数据库GeneCards、OMIM获得变应性鼻炎的靶点集，通过R语言将其与中药靶点相映射，从中筛选出共同活性靶点，运用Cytoscape软件、BisoGenet插件构建中药-活性成分-靶点多维网络及小青龙汤-变应性鼻炎蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，运用CytoNCA插件、R语言分别进行网络拓扑分析、进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：获得核心药对“麻黄-甘草”，核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩素、柚皮素等，核心作用靶点NTRK1、MCM2、CUL3、ESR1、TP53等，涉及通路为AGE-RAGE信号通路、KSHV、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染、乙肝、IL-17信号通路、Th17细胞分化等。结论：小青龙汤可通过干预AGE-RAGE等信号通路抑制核因子κB核基因表调节基因转录，通过介导IL-17细胞因子调节Th17细胞分化进一步调节Th1/Th2平衡达到抗炎、调节免疫作用。

关键词 小青龙汤;变应性鼻炎;网络药理学;作用机制

Abstract Objective：To discuss the mechanism of Xiaoqinglong Decoction （XQL Decoction） in the treatment of allergic rhinitis by network pharmacology.Methods：The ingredients targets of XQL Decoction were acquired from Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform（TCMSP），AR targets were obtained from GeneCards and OMIM database.Then the AR targets and ingredients targets were mutual mapped to find the commontargets，Cytoscape（3.7.1） was used to establish herb-ingredients-targets network and protein-protein interaction network（ppi） and network topology analysis R version was used to gain the GO and KEGG enrichment analysis.Results：Ephedra-liquorice is core herb pair; core ingredients are quercetin，kaempferol，luteolin，baicalein，naringenin，etc.Core targets are NTRK1，MCM2，CUL3，ESR1，TP53，UBC，etc.AGE-RAGE，KSHV，TNF signaling pathway，Hu-man cytomegalovirus infection，hepatitis B，IL-17 signaling pathway，Th17 cell differentiation are involved.Conclusion：XQL Decoction can inhibit NF-κB nuclear gene table regulation gene transcription by interfering with AGE-RAGE and other signaling pathways，and regulate Th1/Th2 balance by mediating IL-17 cytokines to regulate Th17 cell differentiation to achieve anti-inflammatory and immune regulation effects.

Keywords Xiaoqinglong Decoction; Allergic Rhinitis; Network Pharmacoloy; Machanism

中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.008

变应性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是临床最常见疾病之一，其发病率逐年上升，且日渐年轻化，目前全球患病人数已达5亿，对患者的生命质量、精神压力、经济负担均带来很大影响[1]。此外，AR常导致多种并发症，如哮喘、鼻-鼻窦炎、分泌性中耳炎、过敏性结膜炎等。目前西医治疗AR主要是药物治疗及免疫治疗，药物治疗易出现鼻部及嗅觉障碍不良反应，免疫治疗局限性较大，而中医药治疗AR的经验古有之，临床实践疗效可靠，具有独特优势。

变应性鼻炎归属于中医的“鼻鼽”“鼽涕”，其病机为肺气虚寒，津液停聚。历代医家对变应性鼻炎的治疗积累了丰富的古方验方，小青龙汤是其中之一，《伤寒论》记载：“伤寒表不解，心下有水气。”揭示其病机外有表寒不解，内有水饮内停，表寒不解外袭肺系则鼻塞鼻痒，咳嗽咳痰，甚至恶寒发热;水饮内停，气虚津聚，或鼻干，或鼻流清涕，进一步揭示了小青龙汤符合变应性鼻炎的病机，其疗效已被历代临床医家所证实，但具体机制有待进一步研究。

网络药理学在现代基因组学、蛋白质组学、代谢组学等基础上进一步发展，引入系统生物学视角，以全基因组为范畴，涉及多基因、多通路、多途径，从宏观到微观的分子功能网络化相互作用过程，寻找组合式药物靶标研究药物与疾病的作用途径。本研究采用网络药理学方法探讨小青龙汤作用于变应性鼻炎的相关机制，为小青龙汤的临床应用提供进一步的证据支持。

1 资料与方法

1.1 小青龙汤活性成分及靶点数据收集 利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索小青龙汤中麻黄（Ephedra Herba）、桂枝（Cinnamomi Ramulus）、半夏（Arum Ternatum Thunb）、干姜（Zingiberis Rhizoma）、细辛（Asari Radix Et Rhizoma）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、北五味子（Schisandrae Chinensis Fructus）、甘草（licorice）的化学成分及其相关ADME参数。依据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）OB≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）DL≥0.18，在TCSMP中检索各中药活性成分的靶点蛋白，删减重复后进行归一整合，最终获得小青龙汤各中药活性成分及其靶点数据集。

1.2 变应性鼻炎靶点信息收集 基于OMIM（https：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org）国际疾病数据库，以“Allergic Rhinitis”“Rhinitis”等为检索词，检索变应性鼻炎相关靶点，删减重复并归一整合获得变应性鼻炎靶点集。

1.3 小青龙汤和AR相互作用网络构建 将中药有效成分靶点基因与AR疾病靶点基因利用R语言筛选出共同靶点基因，并绘制韦恩图。将中药活性成分及其靶蛋白数据集导入Cytoscape 3.7.1软件，利用Cytoscape 3.7.1、软件及其BisoGenet插件进行构建中药-活性成分-靶点网络。

1.4 靶点网络分析 利用Cytocsape 3.7.1软件及其BisoGenet插件导入共同靶点基因构建药物与疾病相关蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，分析如下：1）关键网络提取：对该网络中各靶点的点度中心性（Degree Centrality，DC）值分布进行统计分析，找到连接节点数目较高的、相互作用比较紧密的靶点蛋白，构建关键靶点的相互作用网络，再依据对关键靶点网络图中的各靶点的中介中心性（Betweenness Centrality，BC）值分布进行统计分析进一步行网络拓扑分析，获取核心靶点，构建核心网络。2）利用R语言、Bioconductor平台（http：//bioconductor.org/biocLite.R）对构建的核心网络进行更深入的基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以探讨其生理功能过程。具体过程如下：R语言中R包安装包括#install.packages（“colorspace”），#install.packages（“stringi”），#install.packages（“ggplot2”），#install.packages（“BiocManager”），#BiocManagerinstall（“DOSE”，#BiocManager install（“clusterProfiler”），#BiocManager install（“enrichplot”）获取GO富集分析表格，KEGG富集分析通路图，并获取GO、KEGG富集分析bubble气泡图、barplot柱状图。P值代表富集的显著性，P值越小代表富集越显著，颜色越红，纵坐标表示GO的名字，横坐标表示附着于GO上基因的数目。

2 结果

2.1 小青龙汤生物信息数据 小青龙汤各中药化学成分结果为：麻黄363个、桂枝220个、半夏116个、干姜148个、细辛192个、白芍85个、五味子130个、甘草280个。其中，符合OB≥30%，DL≥0.18的活性成分结果为：麻黄23个、桂枝7个、半夏13个、干姜5个、细辛8个、白芍13個、五味子8个、甘草92个、除重后共得150个，靶点蛋白2 884个，除去这些活性成分中未匹配靶点者，用于进一步研究的靶点2 477个，最后排除活性成分靶点中重复作用靶点和通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）标准化处理排除非人体作用靶点，共得作用靶点258个。

2.2 变应性鼻炎靶点数据 基于国际生物信息数据库共检索得变应性鼻炎靶点：GeneCard 2 073个靶点，OMIM 6个靶点，除去重复靶点后得2 074个靶点。对检索的靶点名称进行标准化处理，以方便进一步研究。

2.3 共同靶点基因韦恩图

小青龙汤中258个有效成分靶点基因与变应性鼻炎2 074个靶点基因取交集共获得112共同靶点基因。见图1。

2.3.1 中药-活性成分-靶点网络 经Cytoscape软件分析可得，麻黄和甘草的活性成分槲皮素拥有靶点最多（Quercetin，141个），其次为山柰酚（Kaempferol，56个），木犀草素（Luteolin，54个），柚皮素（Naringenin，34个），黄芩素（Baicalein，34个），Β-谷甾醇（Beta-Sitosterol，28个），从作用靶点的角度，连接点前5的靶点分别是孕酮受体（Progesterone Receptor，PGR），核受体共激活因子2（Nuclear Receptor Coactivator 2，NCOA2），前列腺素G/H合酶1（Prostaglandin G/H Synthase 1，PTGS1），前列腺素G/H合酶2（Prostaglandin G/H Synthase 2，PTGS2），细胞外热休克蛋白90Α（Heat Shock Protein 90 Alpha Family Classa Memeber1，HSP90AA1）。见图2。结果可以看出网络图中存在某些活性成分同时作用于多个靶点，同时某些靶点可以被多个不同活性成分共同作用。

2.4 网络拓扑分析、GO富集分析及KEGG富集分析

2.4.1 网络拓扑分析 将获112个共同靶点上传至BisoGenet构建蛋白相互作用网络，图中节点表示蛋白，边表示相关性，共涉及5 002个节点，123 930条边，通过基因相互连接次数选取Degree≥100作为关键靶点，共有节点597个，再通过BC≥600进行核心靶点筛选，构建核心网络，排名前5位的是：神经营养受体酪氨酸激酶1（NTRK1）、微染色体维持复合物组分2（MCM2）、Cullin-3（CUL3）、雌激素受体1（ESR1）、肿瘤蛋白53（TP53）。见图3。

2.4.2 GO富集分析 GO分析得MF（分子功能）、CC（细胞组分）、BP（生物过程）各127条、45条、1 882条，经R语言运行后分别获得前20个分子功能、细胞组分、生物过程的GO功能富集分析的柱状图及barplot图。小青龙汤治疗变应性鼻炎的治疗效应的发挥主要在细胞膜区、细胞质膜区、细胞质内囊泡腔区等微结构区域。见图4。小青龙汤治疗变应性鼻炎涉及的分子功能包括磷酸酶的结合、蛋白磷酸酶的结合等酶的结合以及受体的结合和激活，以及DNA、RNA转录因子的结合与激活过程。见图5。小青龙汤治疗变应性鼻炎主要通过参与信号转导、跨膜运输以及应对病原微生物的侵袭等相关生物过程发挥重要作用。见图6。

2.4.3 KEGG富集分析 KEGG通路富集分析获得158条通路，将显著性前20的结果获得bubble图。AGE-RAGE信号通路具有最高的P值，包含最多的靶点数目，具有最高的靶点通路匹配比。见图7。纵坐标表示通路的名称，横坐标表示富集的基因数目，颜色表示P值，P值越小颜色越红，显著性越高，P值越大，颜色越蓝，同时获得显著性较高的KEGG通路与相关靶点基因网络图。小青龙汤治疗变应性鼻炎的关键基因靶点主要富集的通路AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、IL-17信号通路、Th17细胞分化（Th17 Cell Differentiation）、弓形虫病、麻疹。见图8。Gene Ratio：指该通路中所含靶点的数目占该通路所含靶点数目的比率，此处定义为靶点-通路匹配比。

3 讨论

通过网络药理学方法剖析小青龙汤治疗变应性鼻炎的相关机制，可以得知，活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、黄芩素、β-谷甾醇作用靶点最为丰富，均具有抗炎、抗过敏、免疫调节作用。槲皮素通过调节Th1/Th2的平衡，并抑制抗原特异性Ige抗体的形成，以及抑制酶的活性和嗜酸性粒细胞的生成，来发挥抗炎及免疫调节的作用[2]。山柰酚通过调节JL-32和TSLP显著降低AR小鼠鼻黏膜组织中的Caspase-1活性发挥抗炎、抗过敏作用[3]。Jang等[4]证明木犀草素通过调节核因子κB通路抑制Th2细胞释放炎症介质[5]，抑制TNF-α诱导内皮细胞上ICAM分子表达[6]来发挥免疫调节的作用。核受体共激活因子（NCOA2）通过与转录激活因子（RTA）的竞争结合，从而激活KSHV，达到宿主的持续感染和病毒致癌状态[7]。细胞外热休克家族蛋白HSP90AA1在经过敏原特异性免疫疗法（SIT）治疗的儿童变应性鼻炎、过敏性哮喘中表现出明显的超甲基化，可作为变应性鼻炎免疫疗法疗效评价指标之一[8]，同时相关研究表明PTGS1参与巨噬细胞和单核细胞的分化[9]。故活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、黄芩素、β-谷甾醇为小青龙汤治疗变应性鼻炎的核心活性成分，且为麻黄、甘草药对共同活性成分，同时本方为麻黄汤类方，麻黄甘草汤为最核心的药对成分，故麻黄、甘草为核心药对。网络拓扑分析中NTRK1、MCM2、CUL3、ESR1、TP53为连接节点数目最多、相互作用最为紧密的靶点蛋白，其中CUL3在细胞周期、细胞增殖与分化、信号转导、炎症介质通路等多种细胞生理过程发挥重要作用，泛素E3连接酶N端规则连接UBR家族蛋白2（UBR2）抑制Nalp1b炎性体及Caspase-1活性这一炎症介质信号通路已有相关文献报道，高亲和力神经生长因子（NTRK1）主要与细胞增殖、炎症介质、细胞凋亡抑制等信号通路相关，微染色体维持复合物组件2（MCM2）在DNA复制中起重要作用，主要参与抑制肿瘤细胞增殖[10]。

GO分析可知小青龙汤效应发挥的细胞部位结构和功能相一致性，通过参与蛋白质代谢调控过程的物质轉运过程，酶受体结合与激活过程，病原微生物侵袭过程参与氧化应激反应、细菌源分子的反应等复杂生物过程发挥治疗AR的作用。

小青龙汤治疗变应性鼻炎包含多条通路，根据KEGG富集分析可知，AGE-RAGE信号通路、KSHV、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染、IL-17信号通路、Th17细胞分化等为关键通路。其中，AGE-RAGE信号通路是近年来信号转导途径研究的重点和热点，AGEs的形成不仅与高血糖和高血脂状态有关，而且与体内其他平衡如衰老[11]，氧化还原失衡[12]或自身免疫疾病[13]失衡相关。RAGE通常在肺、心脏、脉管系统、脑、肝、胚胎组织等多种组织中表达，同时在局部炎症区域或受炎症疾病影响的组织中过度表达。作为无菌的危险信号，AGEs与包含RAGE在内的细胞表面受体相互作用，导致炎症反应[14]。具体机制如下： 1）激活蛋白激酶（MAPK）和核因子κB来影响免疫和氧化应激反应，发挥抵抗组织损伤、氧化应激并逆转胰岛素抵抗，抗低度炎症反应; 2）AGEs[15]作为与核因子κB激活有关的外源性物质，当多种细胞外刺激导致核因子κB迅速磷酸化，AGEs与核因子κB结合，发挥调节基因转录的作用，引起一系列炎症反应; 3）在细胞应激信号感应过程中，AGEs[16]激活核苷酸结合寡（NLRP3）炎性小体[17]，通过调节NLRP3炎性小体调节的炎症介质IL-1β的过度表达，调节多种自身炎症或自身免疫性病理过程[16]; 4）AGEs通过显著提高RAGE的mRNA和蛋白表达来发挥促炎症反应[18]，研究表明姜黄素等某些天然物质具有抑制AGE-RAGE受体-配体轴作用，干预相关血管损伤和糖尿病长期并发症的发生，具有明显的抗炎活性[19]。鼻黏膜中IL-17的表达与鼻嗜酸性粒细胞增多和AR的临床严重程度有关[20]。IL-17通过诱导趋化因子和炎症介质的产生来介导组织炎症，并通过调节先天免疫来增强过敏性炎症。IL-17诱导Th2细胞活化，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞积累以及血清IgE产生。IL-17是Th17细胞产生的关键细胞因子。作为近年来新识别的T细胞调节亚群Th17细胞因子，Th17的发现使Th1/Th2平衡模式变得更加复杂，使Th1细胞因子的功能受到重视，并扩大了关于AR发病机制的认识[21-22]。Th17细胞分化途径的研究成果必将为变应性鼻炎的治疗提供新的靶点。

本研究結果结合已有报道发现，小青龙汤可通过干预AGE-RAGE等信号通路抑制核因子κB核基因表调节基因转录，通过介导IL-17细胞因子调节Th17细胞分化进一步调节Th1/Th2平衡达到抗炎、调节免疫作用。

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（2020-11-26收稿 责任编辑：魏庆双）