脑卒中干预途径：靶向NMDA 受体

孙华利 毛森林 王心悦 王毅飞 付 锦△

1）哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150000 2）哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨150000

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是导致认知障碍、残疾和死亡的主要原因［1］。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中大多数是缺血性脑卒中，由于脑动脉血栓或栓塞堵塞，导致脑部血液循环障碍，缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化，引起一系列复杂的病理生理反应，其中包括突触和突触外谷氨酸的积累，离子通道功能紊乱等，最终导致神经元细胞死亡和缺血性脑损伤。

目前公认的治疗脑卒中的方法包括静脉溶栓（包括组织纤溶酶原激活剂、尿激酶等）和动脉机械取栓术，其目的是使闭塞血管内得到再灌注［2-3］。然而再灌注时可能会出现脑出血的风险，且由于治疗时间窗有限，这两种治疗方法仅适用于一小部分脑卒中的患者。因此，寻找更安全的治疗脑卒中药物依然是医学上的一大需求。

脑卒中后大脑中的神经元死亡是一个活跃且持续时间较长的过程，了解潜在的死亡信号机制可将卒中损害降至最低，目前研究最深入的缺血性细胞死亡机制之一是兴奋性毒性［4］。谷氨酸作为中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，在缺血性脑卒中期间发挥重要的作用。由于缺乏稳定的血液流动，大脑缺氧，神经元无法维持正常的离子梯度电位，导致大量神经递质释放，特别是谷氨酸盐［5］，谷氨酸在细胞外间隙大量积聚，导致突触后神经元谷氨酸受体过度激活，引起神经元的损伤。

谷氨酸主要通过结合两个受体挥作用，即离子型和代谢型受体。离子型谷氨酸受体是配体门控离子通道包括N-甲基D-天冬氨酸受体（NMDARs）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPARs）和红藻氨酸受体（KAR）。NMDA、AMPA受体通过允许离子（主要是Ca2+离子）进入细胞，介导谷氨酸的快速兴奋作用。同时红藻氨酸受体通过允许钠和钾离子通过细胞膜来发挥其功能［6］。在兴奋性毒性中过量的谷氨酸释放会导致离子型谷氨酸受体的过度激活，从而导致钙离子的不断涌入。Ca2+离子的异常内流触发多种钙调节过程，如蛋白酶、核酸内切酶、NO 合成酶的激活、自由基的产生和线粒体膜的破坏［6］等一系列下游促死亡信号反应。在离子型谷氨酸受体家族中，NMDAR 在介导Ca2+离子内流方面是最有效的，因此其拮抗剂被广泛认为是潜在的神经保护剂［7］。代谢型谷氨酸受体是G 蛋白偶联受体（GPCRs），通过其下游信号级联发挥作用，介导较慢的神经传递，主要起调节作用［6］。

代谢型谷氨酸受体1（mGluR1）是脑卒中相关研究中的另一种谷氨酸受体。由于NMDAR和mGluR1都位于突触后膜上，因此有可能形成相互作用［6］。研究发现使用小鼠tMCAO 模型，干扰肽（TATmGluR1 T871-N885 或 TAT-mGluR1P1062-L1085）作用于mGluR1 -NMDAR 蛋白复合物，可降低梗死程度，具有神经保护作用［6］。其他报告也表明mGluR1 的拮抗剂可以预防卒中动物模型中的神经元损伤［8-9］。

NMDA型谷氨酸受体介导的兴奋性毒性一直是脑卒中研究的热点。许多重要的神经功能包括突触可塑性、记忆形成、情绪控制、大脑发育和神经元存活都需要NMDAR 的生理活性。本文着重介绍了NMDAR 激活在脑卒中的双重作用、潜在机制，以及基于NMDAR信号通路治疗脑卒中的最新发现。

1 NMDA受体在神经元存活和死亡中的双重作用

NMDAR 是四聚体组合体，包括两个GluN1 和两个GluN2亚基，分别与共晶体甘氨酸和谷氨酸结合。GluN2 亚型（GluN2A、GluN2B、GluN2C 和GluN2D）及GluN3A 和GluN3B 在中枢神经系统中都具有不同的性质和表达模式［10］。双重作用可能取决于被激活的受体的亚型。“NMDAR 亚型”假说指出，激活含GluN2A 的NMDARs 导致神经元存活和对缺血损伤的神经保护，而激活含GluN2B的NMDARs可导致兴奋性毒性和神经元凋亡［11-12］。在成人大脑中含GluN2B 的NMDAR 在突触外部位富集，而含GluN2A的NMDAR在突触高度表达。此外，GluN2C、GluN2D以及GluN3A和GluN3B亚基在介导神经元存活和死亡方面发挥重要作用，如在大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中动物模型中敲除GluN3A 基因小鼠梗死体积明显大于野生型（WT）小鼠［13］。对于NMDA 受体亚型的研究为缺血性卒中提供了新的治疗方法。NMDAR 在神经元存活和死亡中的双重作用可能取决于被激活的受体的亚型。

2 基于NMDAR受体的干预措施

2.1 NMDAR 受体拮抗剂与激动剂 最新研究发现，在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中，NMDAR 拮抗剂（MK801）仅对小鼠行为有药理作用，未能显示出对脑梗死的神经保护作用［14］。但并不能克服NMDAR 拮抗剂在许多缺血动物模型（包括MCAO模型）中具有强烈神经保护作用的广泛证据［7,15-16］，特别是已开发出含有GluN2B 的NMDAR 特异性拮抗剂（CP-101,606），研究证明其对卒中损伤有效［17］。然而，由于治疗时间窗有限、不良反应严重或缺乏临床疗效，这些或类似药物的临床试验令人失望［18］。近年来，在低pH 下作用的pH 敏感拮抗剂被开发出来，可以在缺血区特异性靶向含GluN2B的NMDAR。与传统NMDAR 抑制剂（如氯胺酮和ro25-6981）相比，该拮抗剂家族的一个主要候选基因93-31 在tMCAO 小鼠中获得类似的神经保护效果和较少的不良反应［19］。这种新一代含GluN2B 的NMDAR 拮抗剂可能对卒中患者更具耐受性。然而，这种基于拮抗剂的化合物可能仍然遭受与传统含GluN2B 的NMDAR 拮抗剂相同的短治疗窗口，因此，如果给药太晚（即在执行GluN2B 依赖程序细胞死亡信号通路之后），则不能对抗下游细胞死亡信号。

相比之下，增强含GluN2A的NMDA受体可促进细胞存活。最近开发出GluN2A 特异性正变构调节剂（PAM）［20］，包括GNE-6901。这些新的GluN2A 特异性PAM 通过激活神经元存活信号保护神经元免受兴奋性毒性，比传统的NMDAR拮抗剂具有更长的治疗时间和更少的不良反应。因此，选择性增强含GluN2A 的NMDAR，相对于阻断NMDAR，是卒中的一种更有前途的治疗方法。

2.2 靶向NMDAR 促死亡途径：NDC（死亡信号复合物）中的相关蛋白

2.2.1 GluN2B-PSD95-nNOS 复 合 物：GluN2B -PSD95-nNOS 信号复合物是神经元死亡信号蛋白与GluN2BRs形成蛋白复合物，在这个复合物中，PSD95作为支架蛋白将nNOS（神经元型一氧化氮合酶）与NMDA受体组装在一起［21］。其中干扰兴奋性毒性中NO 生成的一种方法是使用干扰肽（Tat-NR2B9c）结合PSD95或nNOS，从而干扰NMDAR激活nNOS的能力。这种肽可降低颅内动脉瘤血管内修复患者的医源性缺血性脑梗死发生率［22］。由于它仅针对NMDAR-nNOS信号通路，因此其不良反应要比在细胞表面阻断NMDAR 的传统抑制剂小得多。但最新研究表明，Tat-NR2B9c在dMCAO模型中不能预防脑梗死［14］。相关报道显示［23］，在动物模型中小分子化合物（ZL006）可以阻断nNOS-PSD-95 的结合，改善大脑中动脉闭塞（MCAO）或再灌注引起的局灶性脑缺血损伤。

2.2.2 GluN2B-DAPK1-p53 复合物：死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）是一种钙离子/钙调素（CaM）依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活性与凋亡细胞死亡相关［24］。已有报告称，DAPK1 基因的缺失或给予药物（如Tat-NR2BCT）破坏GluN2B-DAPK1 相互作用可以保护小鼠免受卒中损伤［25］，且使用DAPK1-p53阻断剂Tat-p53DM对OGD诱导的细胞凋亡和坏死具有高度的神经保护作用［26］。

2.2.3 GluN2B NMDAR-PTEN：抑癌基因PTEN（在10 号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）具有脂类和蛋白质磷酸酶活性，PTEN的基因敲除在脑缺血中具有神经保护作用［27］。NMDA的兴奋毒性可导致神经元中PTEN核易位，大鼠局灶性缺血模型证明Tat-K13 不仅可以减少缺血诱导的PTEN核易位，也可以有效地防止缺血性脑损伤［28］，即使在卒中后6 h应用也是有效的［28］。

2.2.4 NMDAR-Src-Panx1 complex：体外和体内的缺血性卒中模型证明NMDAR 通过一种不需要受体离子通道的机制导致神经元死亡。这种机制需要配体结合，但与NMDARs 中的Ca2+内流无关。WEIL⁃INGER 等［29］报告了一种由NMDARs、肉瘤（Src）激酶和pannexin-1（Panx1）通道组成的信号复合物的存在，这种复合物与膜泡形成、Ca2+失调、线粒体功能障碍和细胞死亡以及卒中后的神经功能缺损有关。使用干扰肽Tat-panx308 阻断Panx1 C 端的Y308 位点，可以减少MCAO 后的梗死面积，具有神经保护作用［29］。

2.2.5 DLK（双亮氨酸拉链激酶）：在成熟的神经元中DLK 存在于突触中，并与多种已知的突触后密度蛋白（包括支架蛋白PSD-95）相互作用。DLK 基因敲除减弱了JNK/c-Jun应激反应途径的活化，降低了红藻氨酸诱导的神经退行性病变的水平［30］。最近人们发现了一种有效的DLK选择性抑制剂GNE-3511，其在神经退行性病变和神经毒性的体内模型中具有神经保护作用［31-32］。

3 靶向NDC（死亡信号复合物）下游的死亡信号蛋白

NMDAR 介导的兴奋性神经元死亡的新靶点不仅局限于NDC，还包括NDC 下游的死亡信号蛋白。（1）钙蛋白酶（Calpains）：钙依赖性半胱氨酸蛋白酶Calpain 参与NMDAR 介导的兴奋毒性，激活Calpain可以诱导细胞死亡，且Calpain 还介导Kidins220/ARMS 下调［33］、纹状体富集蛋白酪氨酸磷酸酶（STEP）［34］以及代谢型谷氨酸受体1（mGluR1）［35］的裂解。阻断这些下游死亡信号蛋白可提供更宽的治疗时间窗，即使在卒中后6 h 给予治疗，Calpain 抑制剂SNJ-1945 在小鼠脑缺血中也显示出神经保护作用［36］，并且Tat-K（干扰Calpain 介导的Kidins220的裂解［37］）、Tat STEP（干扰calpain 介导STEP［34］的裂解）和TatmGluR1（干扰Calpain 介导的mGluR1 的裂解［35］）也能够防止体外和体内兴奋性毒性导致的神经元死亡。（2）促分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）：MAPKs 蛋白家族中p38 和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）在兴奋毒性期间被激活［38］，介导神经元凋亡。p38 抑制剂（SB-203580 和SB-239063）和JNK抑制剂（TatJBD20）可防止体外和体内脑卒中模型中NMDAR 介导的神经元死亡［38-40］。即使在卒中发作后6 h 或12 h 给予药物治疗，也具有神经保护作用［40］。（3）甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）：神经元中的甾醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）转录因子的激活在卒中体外和体内模型中NMDAR 介导的兴奋性毒性神经元死亡中起重要作用，Insig-1 衍生干扰肽（Indip）已被开发用来阻断SREBP 的核转位，使用MCAO模型证实了其对卒中损伤的治疗潜力［41］。（4）α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPARs）的内吞作用：AMPAR 的内吞作用对N-甲基-D-天冬氨酸诱导的神经元凋亡至关重要，使用干扰肽可以特异性抑制AMPAR 内吞作用，具有神经保护作用［42］。

4 总结与展望

NMDAR在神经元存活和死亡中的双重作用，总结NMDAR 最新研究进展，更好地解释了NMDAR 拮抗剂应用在临床中失败的原因，并且对于开发基于NMDAR 的更有效的神经保护药物提供了更好的科学基础。此外，作用于NMDAR下游死亡信号蛋白质的干扰肽也被开发出来，这些干扰肽能够特异性地抑制下游死亡信号而不影响受体的其他功能信号，比传统NMDAR阻滞剂的不良反应小，且具有更宽的治疗时间窗口，为临床治疗脑卒中提供了更有效的新疗法。