基于网络药理学探讨麻黄汤治疗新型冠状病毒肺炎所致发热的分子机制▲

唐秀松 方 刚 罗 俊 黄 安 陈秋霞 陈 静

(广西中医药大学壮瑶药工程技术研究中心， 南宁市 530200，电子邮箱：1145330495@qq.com)

2019年12月底新型冠状病毒肺炎疫情的爆发，对我国人民生命健康造成严重危害，该病具有传播速度快、传染性强、人群普遍易感的特征，临床多表现为发热、干咳、乏力，严重者可出现呼吸窘迫，多脏器功能衰竭甚至死亡[1-4]。中医认为，新型冠状病毒肺炎属于“温疫”范畴，其病因病机为湿饮停聚，外加风热疫毒，肝木乘克脾土，脾虚运化无权，湿邪内生所致；病位在三焦或膜原，侵犯脾肺，可累及心、肝、肾、大肠；治疗上主张以内清热、外凉解法治之[5-6]。中医中药在新型冠状病毒肺炎的治疗上发挥了极为关键的作用，包括临床上常见的清肺排毒汤、连花清瘟颗粒、化湿败毒汤、疏风解毒胶囊等，并且治疗效果明显，且不少中药方剂或中成药被纳入了新型冠状病毒肺炎诊疗方案[7]。然而，很多中药发挥治疗作用的药理机制却尚未明确。

麻黄汤出自张仲景的《伤寒论》，是经典名方之一，具有发汗解表、宣肺平喘之功效[8]。在此次疫情中，以麻黄汤为基础方加减组成的方剂也发挥了很重要的作用，经典的清肺排毒汤即包含了麻黄、桂枝、炙甘草、炒苦杏仁四味药物，在张治国的“药人”学说中，麻黄汤也被推荐作为治疗体格粗壮、皮肤较粗糙且干燥型的新型冠状病毒肺炎患者的处方之一[9]。网络药理学是构建药物与疾病之间“成分-靶点-通路-疾病”网络关系，并能将其作用机制进行可视化的一种高效方法，它是一种基于系统生物学来从整体的角度综合分析药物对疾病网络的干预与影响的一门学科[10]。网络药理学能够有效预测药物功能或特定功能所对应的药物，是目前中药药效物质基础研究的重要手段之一[11]。因此，本研究借助网络药理学方法，对麻黄汤缓解新型冠状病毒肺炎所致发热的分子机制进行研究，以期为麻黄汤的临床进一步应用提供理论依据及用药选择。

1 资料与方法

1.1 麻黄汤有效活性成分与相关靶点的筛选 分别以麻黄汤中各个药物的名称(麻黄、桂枝、苦杏仁、甘草)为关键词，在中药系统药理学数据库和分析平台(http://ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php)中进行检索，按照生物利用度≥30%、类药性≥0.18进行有效成分筛选[12]。在中药系统药理学数据库和分析平台的“Related Targets”栏目中收集麻黄汤有效活性成分的相关靶点(药物靶点)；再在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中，利用Perl脚本对药物靶点进行基因注释后获取其对应的人类基因，去除重复项后得到麻黄汤药效成分调控的靶点。

1.2 疾病靶点基因收集 在OMIM数据库(http://omim.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中输入关键词“fever”，搜索与发热相关的疾病靶点[13]，去除重复靶点后得到疾病相关靶点。运用Venny平台(版本2.1,http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将麻黄汤药效成分调控的靶点与发热的治疗靶点取交集，得到麻黄汤治疗发热的靶点基因，即药物-疾病交集的靶点基因(共194个)。

1.3 PPI网络构建及关键基因可视化 在STRING数据库(https://string-db.org)中导入194个药物-疾病交集的靶点基因，选择检测物种为人(Homo sapiens)，去除离散或无关联的基因节点，取medium confidence值=0.04为筛选标准，最终得出相应蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图。按照基因Count值由大到小排序，选取前30个基因作为关键基因，运用R×64 3.6.1软件中的count.R程序包对PPI网络中的关键基因进行可视化，绘制树状图。

1.4 靶点基因功能富集分析及通路富集分析 将所得194个交集基因导入R×64 3.6.1软件，进行基因本体(Gene Ontology，GO)分类富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 麻黄汤有效活性成分与相关靶点 麻黄汤中的有效活性成分共141个，主要包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-儿茶素、柚皮苷、没食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等；获得潜在相关靶点数9 770个，去除重复项后结果得到麻黄汤对应的人类基因靶点222个。见表1。

表1 麻黄汤的活性成分、有效活性成分、潜在相关靶点数(n)

2.2 麻黄汤治疗发热的靶点基因 去除重复靶点后得到疾病相关靶点7 073个。运用Venny平台取交集后得到麻黄汤治疗发热的靶点基因共194个，见图1。

图1 麻黄汤与新型冠状病毒肺炎所致发热的交集靶点

2.3 PPI网络及关键基因可视化结果 所构建的PPI网络中有194个节点，3 642条边，平均每个节点的度为37.5，平均局部聚类系数为0.593，PPI富集程度(P值)为<1016，见图2。同时运用R×64 3.6.1软件对网络中的30个关键基因进行可视化，绘制树状图，见图3。

图2 麻黄汤治疗新型冠状病毒肺炎所致发热的PPI网络

图3 PPI网络中的核心靶点蛋白

2.4 交集靶点基因的GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO分析共得到170个主要生物过程，主要涉及DNA结合转录激活剂活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体活性等，见表2；KEGG通路富集分析结果显示其主要涉及胞内磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路、低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信号通路、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信号通路、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信号通路等46个信号通路，见表3。

表2 GO功能富集分析结果(前20个生物过程)

表3 KEGG信号通路富集分析结果(前20个通路)

3 讨 论

麻黄汤为经典方剂之一，其具有很强的代表性，其组方精练，功效显著，是临床治疗外感病的基础方剂[14]。柯琴在《伤寒来苏集》中的“伤寒附翼”卷上对麻黄汤做出了较高的评价：“此汤入胃，行气于玄府，输精于皮毛，斯毛脉合精而溱溱汗出，在表之邪，其尽去而不留，痛止喘平，寒热顿解，不烦啜粥而籍汗于谷也”[15]。现代药理研究表明，麻黄汤的有效组分不仅可抑制发热大鼠致热因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α的释放，还可降低体温升高幅度，此外麻黄汤饮片汤剂同时还具有止咳、抗炎的效果[16-17]。

本研究通过网络药理学的方法分析麻黄汤治疗新型冠状病毒肺炎所致发热的作用机制，结果显示，麻黄汤有效活性成分共141个，相关预测潜在靶点9 770个，与新型冠状病毒肺炎所致发热共有靶点194个，筛选出30个关键基因，GO基因富集分析得到主要生物过程170个，KEGG通路分析得到信号通路46条，这说明麻黄汤具有通过多成分、多靶点、多通路来缓解新型冠状病毒肺炎所致发热的作用。

本研究中，PPI网络中的前30个关键核心靶点蛋白包括STAT3、AKT1、JUN、MAPK1、IL-6、CXCL2、VEGFA、IL-1B等，大多数是与诱导炎症发生发展有关的蛋白。而新型冠状病毒肺炎是一种由病毒感染而引起机体产生一系列炎症反应的过程，并且炎症的加重与细胞因子风暴息息相关[18]。本研究结果还显示，麻黄汤的主要有效活性成分包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-儿茶素、柚皮苷、没食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等。而槲皮素不仅具有抗氧化、抗炎作用，而且能作用于信号通路相关蛋白，如PI3K-Akt通路、酪氨酸激酶等，同时槲皮素可与新型冠状病毒3CL水解酶结合而发挥抗病毒作用[19-20]。此外，豆甾醇[21]、木犀草素[22]、β-谷固醇[23]、(+)-儿茶素[24]、柚皮苷[25]、没食子酸[26]等均具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。

本研究GO生物过程功能富集结果显示，麻黄汤缓解新型冠状病毒肺炎所致发热的生物过程主要集中于酶活性、受体激活、因子结合等方面，KEGG通路富集结果显示其作用途径主要有PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、cGMP-PKG信号通路等。其中，PI3K-Akt信号通路是一种重要的细胞内信号转导通路，其对细胞功能具有重要影响，此通路的异常激活导致抗凋亡基因高表达，与炎症发生发展密切相关[27]。HIF-1信号通路可能通过调节有关基因的表达来影响细胞凋亡等，进而维持全身细胞、组织的氧稳定并使它们耐受低氧状态，以减少缺氧对全身细胞、组织带来的损害[28]。在脓毒症发病过程中，NF-κB信号通路具有重要介导作用，其正反馈调节可增强促炎因子基因的转录，其负反馈调节则能抑制促炎因子的表达，当正负反馈调节失衡时就会引起严重的炎症反应,甚至是脓毒症,最终导致多功能障碍综合征[29]。cGMP-PKG信号通路则与组织缺血/再灌注损伤有关，研究表明，一氧化氮-环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶G信号通路与低氧诱导的细胞免疫逃避密切相关,可抑制或激活该信号通路而增强或抑制细胞的免疫逃避[30-31]。

综上所述，麻黄汤缓解新型冠状病毒肺炎所致发热的机制是多靶点、多个生物过程、多途径来共同参与的，其可能是通过抑制炎症反应、减弱病毒活性、保护组织等来缓解细胞因子风暴，从而发挥缓解症状的作用。在实际临床运用中尚需谨守病机，随证施治，为中医药更好地发挥抗击疫情作用贡献中医的智慧和力量。