肝细胞生长因子激酶抑制剂在乳腺癌上皮-间充质转化及细胞增殖侵袭中的作用△

刘海旺，张宏旭，刘燃，郝美玲，李春辉#

承德医学院附属医院1病理科，2乳腺科，3麻醉科，河北 承德 067000

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，按性别估算的10种主要肿瘤类型中，乳腺癌在女性中发病率居第一位，病死率居第二位[1]。已知肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受体c-MET的信号转导与胚胎发育、组织细胞修复密切相关，而HGF/c-MET信号转导的异常调节与肿瘤的发生、发展及恶性生物学行为密切相关，包括肿瘤细胞的侵袭、转移、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及血管生成等[2]。HGF是c-MET的配体，c-MET可以通过自身突变、过表达等途径激活其配体HGF的作用，促使相应的信号转导级联反应，进而对人体生物学和生化功能产生影响[3]。EMT促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和抑制凋亡，在肿瘤侵袭转移中起着重要作用。多个因子如蜗牛家族转录抑制因子1（Snail family transcriptional repressor 1，Snail1）、蜗牛家族转录抑制因子2（Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、上皮钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和波形蛋白（Vimentin），它们在转录和翻译等水平诱导EMT[4]。本研究旨在研究HGF/c-MET激酶抑制剂在乳腺癌EMT及细胞侵袭中的潜在机制，进而了解激酶抑制剂在体内外的作用机制，从而为乳腺癌患者的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌MCF-7细胞购自中国医学科学院基础医学细胞中心。c-MET和E-cad引物均由上海生工公司设计。E-cad、Snail、神经型钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）单克隆抗体均购自Santa Cruz公司，β-actin鼠单克隆抗体和辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗鼠二抗均购自北京中杉金桥生物技术公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RPMI-1640培养基均购自Hy-Clone公司，Transwell小室购自美国康宁公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂均购自TaKaRa试剂公司，CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物公司，PHA-665752小分子抑制剂购自selleck公司，TBST、RIPA裂解液和电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 在37℃、5%CO2条件下培养乳腺癌MCF-7细胞，加入适量含10%FBS的RPMI-1640培养基，细胞每2天换液一次，然后按1∶3比例传代。培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化处理并制备成单细胞悬液，用于后续实验。实验分组包括：空白组（单独培养基）、对照组（培养基+DMSO）、研究组（培养基+0.1 μmol/L PHA-665752组，培养基+0.5 μmol/L PHA-665752组，培养基+1.0 μmol/L PHA-665752组）。

1.2.2 CCK- 8法检测细胞增殖能力 将乳腺癌MCF-7细胞制备成单细胞悬液分别接种于96孔板，每孔100 μl，培养12 h后分为研究组和对照组，继续孵育24 h后，在上述培养基孔中加入终浓度为10%的CCK-8试剂，在37℃培养箱中继续孵育2 h。酶联免疫检测仪于450 nm波长下检测各孔吸光度（A）值，并绘制肿瘤细胞生长曲线。细胞活力（%）=（研究组A值-空白组A值）（/对照组A值-空白组A值）×100%。

1.2.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力 将基膜基质原液和预冷的无血清RPMI-1640培养液按1∶3比例配置上室凝胶液，取50 μl凝胶液均匀覆盖于Transwell小室底部。取处于对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞密度为3×105/ml，吸取100 μl细胞悬液置于上室孵育24 h，再取出Transwell小室，按照说明书进行固定、染色，膜的下室表面细胞即为侵袭细胞，显微镜观察染色细胞，每张片子选取5个视野，统计细胞数目算出平均值，每组设置3个平行小室，重复3次，以穿膜细胞数评价其侵袭能力。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction， qRT-PCR）检测mRNA相对表达量 收集培养皿中的细胞，用Trizol试剂提取乳腺癌MCF-7细胞总RNA。逆转录生成cDNA，用于后续PCR扩增，以β-actin作为内参基因，PCR参数设置：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃ 10 s，40个循环，结果以荧光阈值循环数（Ct）值输出，依据 2-△△Ct公式[5]，计算目的基因相对于内参基因的相对表达量，再进行数据统计分析，每组进行3次实验，取均值。所有上述步骤严格按照说明书操作，引物序列详见表1。

表1 c-MET、E-cad、 β-actin基因的引物序列

1.2.5 蛋白质印迹法（Westernblot）检测蛋白相对表达量 采用蛋白提取试剂盒提取研究组和对照组乳腺癌MCF-7细胞的总蛋白，采用紫外分光光度计测定提取的蛋白质浓度，再经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphatepolyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜至甲醇预处理过的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），再用脱脂牛奶封闭，滴加兔抗人E-cad、N-cad和Snail一抗（1∶500），4℃孵育过夜，加入TBST洗膜，加入HRP标记的二抗（1∶1000）孵育1 h，ECL显示，收集影像，采用凝胶图像处理系统软件分析各组条带灰度值，依据相对灰度值进行统计学分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-MET抑制剂PHA-665752对乳腺癌MCF- 7细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示，分别用0.1、0.5、1.0 μmol/L PHA-665752剂量处理 12、24、48 h后，c-MET激酶抑制剂剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力（F=53.367、116.219、44.758，P＜0.05）。与对照组比较，0.1 μmol/L PHA-665752处理48 h后细胞活力降低（P＜0.05）；与0.1 μmol/L PHA-665752组比较，0.5 μmol/L PHA-665752处理24、48 h后细胞活力均降低（P＜0.05）；与0.5 μmol/L PHA-665752组比较，1.0 μmol/L PHA-665752处理12、24、48 h后细胞活力均降低（P＜0.05）。（表2）

表2 不同时间点各组乳腺癌MCF- 7细胞活力的比较（%）

2.2 乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的比较

Transwell检测结果显示，0.5 μmol/L PHA-665752研究组MCF-7细胞处理24 h后侵袭细胞数为（24.33±1.53），少于对照组的（93.00±5.57），差异有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

图1 Transwell法检测 0.5μmol/LPHA-665752研究组与对照组乳腺癌MCF- 7细胞的侵袭能力（结晶紫染色，×100）

2.3 c-MET、E-cad mRNA相对表达量的比较

处理12 h时，对照组与0.5 μmol/L PHA-665752组乳腺癌MCF-7细胞c-MET、E-cadmRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。处理24 h时，0.5 μmol/L PHA-665752组乳腺癌MCF-7细胞c-METmRNA相对表达量低于对照组，E-cadmRNA相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同时间点两组细胞c-MET、E-cad mRNA相对表达量的比较（± s）

表3 不同时间点两组细胞c-MET、E-cad mRNA相对表达量的比较（± s）

注：*与同时间对照组比较，P＜0.05

指标c-MET mRNA E-cad mRNA 12 h 24 h 12 h 24 h 0.73±0.02 0.51±0.02 0.40±0.03 0.43±0.03 0.66±0.07 0.24±0.05*0.44±0.02 0.66±0.05*时间 对照组0.5 μmol/L PHA-665752 组

2.4 EMT相关蛋白表达情况的比较

通过形态学观察，与对照组相比，0.5 μmol/L PHA-665752组MCF-7细胞处理24 h后较密集、细胞未拉长，未出现EMT形态特点。Western blot结果显示，0.5 μmol/L PHA-665752组 MCF-7细胞E-cad蛋白表达水平高于对照组，N-cad、Snail蛋白表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2、表4）

图2 Western blot法检测对照组与0.5μmol/L PHA-665752组乳腺癌MCF- 7细胞中E-cad、N-cad、Snail蛋白表达情况

表4 0.5 μmol/L PHA-665752组与对照组乳腺癌MCF-7细胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表达水平的比较（±s）

表4 0.5 μmol/L PHA-665752组与对照组乳腺癌MCF-7细胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表达水平的比较（±s）

注：*与对照组比较，P＜0.05

组别对照组0.5 μmol/L PHA-665752组E-cad 0.42±0.02 0.62±0.04*N-cad 0.62±0.03 0.41±0.04*Snail 0.71±0.02 0.34±0.05*

3 讨论

乳腺癌是全世界发病率位居前列的肿瘤，也是女性中最常见的恶性肿瘤，每年新增病例209万例（占女性癌症总数的24.2%），每年因肿瘤导致60万患者死亡[6]。乳腺触诊结合高频超声筛查乳腺癌并进行跟踪随访发现，城镇妇女乳腺癌发病率明显高于农村妇女[7]。c-MET基因位于7号染色体上，由50 kD的胞外α链和140 kD的一个跨膜β链通过二硫键相连形成异二聚体，受体具有自身磷酸化活性特点[8]。c-MET是HGF的细胞表面受体，其蛋白表达与乳腺癌组织学分级和淋巴结转移有关，c-MET在乳腺癌中过表达可能参与乳腺癌的进展[9]。Motomura等[10]研究提示c-MET和PKCλ共同参与了乳腺癌的进展，并导致乳腺癌预后不良。研究证实，结肠癌转移相关基因（metastasis-associated in colon cancer protein 1，MACC-1）与 c-MET共同参与乳腺癌细胞增殖、浸润及血管生成，与组织分化程度、浸润程度、淋巴结转移及临床分期显著相关[11]。本研究中，与对照组比较，使用c-MET激酶抑制剂后c-METmRNA表达受到抑制，E-cadmRNA表达升高，说明c-MET激酶抑制剂PHA-665752可以有效抑制HGF/c-MET信号通路。

当肿瘤发展到一定阶段，细胞侵袭和浸润能力会随着肿瘤的恶性转化而增强。EMT在肿瘤细胞浸润过程中起重要的作用。Tavakolian等[12]研究表明乳腺癌细胞侵袭转移相关的特征与EMT有紧密联系，E-cad的表达下调也能显著增强乳腺癌侵袭转移能力，而给予外源性E-cad则能够抑制乳腺癌的转移；Vimentin表达的增加与肿瘤的侵袭转移呈正相关。周珏等[13]表明E-cad的表达缺失或下调使细胞间的黏附力下降，促使连环蛋白发生易位，从而激活相关的下游信号分子诱导N-cad等的产生，E-cad下调及N-cad的高表达与肿瘤分化差、高侵袭性密切相关。本研究Western blot结果显示，与对照组相比，使用c-MET激酶抑制剂后E-cad蛋白表达水平升高，N-cad和Snail蛋白表达水平下降，说明当上皮细胞间黏附能力得到了一定程度的恢复，上皮细胞的侵袭性和迁移能力显著下降。同时也证明了抑制HGF/c-MET信号通路后乳腺癌EMT及细胞侵袭转移受到显著抑制，且随着抑制剂浓度的增加，EMT及细胞侵袭转移的抑制程度显著增加，表明在一定程度内细胞的EMT及细胞侵袭转移能力与HGF/c-MET信号通路有关。

综上所述，利用c-MET激酶抑制剂影响HGF/c-MET信号通路可以有效抑制乳腺癌EMT及细胞的侵袭和转移，其作用机制可能与降低c-MET、N-cad和Snail蛋白表达，升高E-cad蛋白表达有关。但调控HGF/c-MET信号通路的相关小分子抑制剂较多，在后续的实验中希望可以深入研究c-MET抑制剂对其他信号通路及与HGF/c-MET之间交互机制的作用。