增殖抑制基因/线粒体融合蛋白2在膀胱癌中的表达及意义△

吴颖露，白云，熊艳杰，胡芬

华北理工大学1生命科学学院2018级生物技术专业二班，2生命科学学院，河北 唐山063000

3华北理工大学附属医院病理科，河北 唐山 063000

在泌尿系统恶性肿瘤中膀胱癌发病率居世界第二位[1]，90%的患者为尿路上皮癌。近些年，分子生物学领域研究不断深入，生物技术不断更新，发现膀胱癌是多种基因参与并且发生突变和裂变的过程。增殖抑制基因/线粒体融合蛋白2（hyperplasia suppressor gene/mitofusin 2；HSG/MFN2）与细胞增殖信息传递密切相关，对线粒体功能有着重要作用，参与线粒体融合分裂、增殖凋亡等生物学过程。本研究采用免疫组化和蛋白质印迹法（Western blot）检测HSG/MFN2在膀胱癌组织中的表达情况，探讨其在膀胱癌发生发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年3月至2017年8月于华北理工大学附属医院泌尿外科行手术切除的膀胱癌患者的病历资料。所有患者均经手术病理确诊，手术前均未经过任何化疗、放疗及抗肿瘤药物治疗。共纳入50例膀胱癌患者，其中男28例，女22例，年龄35～75岁，平均（57.7±8.2）岁。选取膀胱癌患者的膀胱癌组织石蜡标本50例及癌旁正常组织石蜡标本20例。

1.2 主要试剂

本研究所用仪器由华北理工大学实验中心提供，兔抗鼠多克隆HSG抗体购自美国santacrua公司；鼠单克隆β-actin抗体购自美国sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购自美国Therm Scientific公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）购自杭州联科生物技术有限公司；SP-9001免疫组化染色试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）及枸橼酸盐均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法

将收集的石蜡标本按常规处理后4 μm连续切片，进行梯度酒精脱水、脱蜡，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作，一抗用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替阴性对照。结果判读：HSG/MFN2蛋白阳性反应主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。根据染色强度和阳性细胞所占百分比的得分之和进行阳性细胞评定。染色强度：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占百分比：无阳性细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分；根据二者得分之和判定结果，0～2分为阴性，3～6分为阳性。

1.4 Western blot方法

将标本从-80℃超低温冰箱中取出研碎，经过蛋白裂解液提取总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，每组取20 μg用于检测不同膀胱组织中HSG/MFN2蛋白含量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜电转印，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗进行杂交，洗膜后加入二抗杂交，再次洗膜后DAB显色，通过凝胶成像系统读取条带密度值进行分析，测定出各组蛋白条带与β-actin的比值作为蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌及癌旁正常组织中HSG/MFN 2蛋白表达情况的比较

膀胱癌组织中HSG/MFN2蛋白的阳性表达率为78%，高于癌旁正常组织的20%，差异有统计学意义（P＜0.05）。膀胱癌组织中HSG/MFN2蛋白相对表达量为（42.75±2.11），高于癌旁正常组织的（24.78±3.63），差异有统计学意义（P＜0.05）。（图1、图2、表1）

表1 膀胱癌及癌旁正常组织中HSG/MFN 2蛋白相对表达量及阳性表达情况的比较

2.2 不同临床特征的膀胱癌患者的膀胱癌组织中HS G/MFN 2蛋白表达情况的比较

不同分化程度、TNM分期和生长方式膀胱癌患者的膀胱癌组织中HSG/MFN2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄及是否淋巴结转移、肌层浸润膀胱癌患者的膀胱癌组织中HSG/MFN2蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征的膀胱癌患者的膀胱癌组织中HSG/MFN 2蛋白表达情况的比较（ n=50）

3 讨论

膀胱癌的发生与家族遗传或基因、细胞因子突变有关，影响信号通路，改变细胞代谢过程，导致多种基因和信号转导通路过度表达，临床上随着病情的进展，患者出现了高肿瘤临床负荷症状[2-3]。膀胱癌的发展机制需要血清学肿瘤指标的进一步诊断。HSG/MFN2是中国学者陈光慧研究大鼠血管平滑肌细胞利用差异显示技术分离得到的基因，命名为细胞增殖抑制基因，后又命名为线粒体融合蛋白2，它位于线粒体外膜，由757个氨基酸残基组成，是能够介导线粒体融合、分裂，对线粒体的形态和功能有着重要调节作用的蛋白质[4-5]，与细胞周期密切关联[6]，并且是一种高度保守的跨膜GTP酶，在肿瘤浸润、细胞恶变和转移过程中起着决定性作用。HSG/MFN2的抗肿瘤作用与Ras信号通路下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路有关[7-8]，能够传递Ca2+信号[9]，应激内质网、细胞凋亡等活动。HSG/MFN2过表达促进了线粒体膜与线粒体的紧密结合，增加线粒体的融合度，线粒体延长扩大，另外发现高表达的细胞在G1期细胞被阻滞，S期及G2期细胞减少。

本研究通过免疫组化和Westen blot法对HSG/MFN2蛋白在膀胱癌及癌旁正常组织中的表达情况进行检测，发现在膀胱癌组织中HSG/MFN2蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织，相对表达量高于癌旁正常组织。在哺乳动物中，线粒体不断地融合分裂，通过这种方式维持其形态结构的动态平衡，肿瘤组织在机体运行过程中代谢过快，线粒体不断调整功能维持本身所需要的能量，因此加快了线粒体的运行，出现HSG/MFN2蛋白在膀胱癌组织中过表达，与丁焕然等[10]在肺癌组织及郭桃英和潘玫[11]在卵巢上皮性癌组织中的检测结果一致，说明HSG/MFN2蛋白可能是膀胱癌的一个潜在的生物标志物，促进线粒体不断分解和融合蛋白活性[12]，平滑肌细胞与α-肌动蛋白的相互作用[13]，改变肌细胞功能。另外，本研究结果显示，HSG/MFN2蛋白在膀胱癌中的表达与分化程度、TNM分期和生长方式有关，随着肿瘤分化程度的加深，HSG/MFN2蛋白阳性表达率越高，说明HSG/MFN2具有促进肿瘤浸润和转移的作用；随着TNM分期升高，HSG/MFN2阳性表达率降低，说明在代谢过程中HSG/MFN2诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖[14]。

综上所述，在膀胱癌组织中HSG/MFN2阳性表达率提高，相对表达量上调，对膀胱组织病变的发展过程有着重要的参与和调控作用。