DAPT和PI-103对人胶质瘤干细胞侵袭、迁移能力的影响

周星辰，闵敬亮，束汉生，王大巍，程哲，张辉，王昊，杨光

蚌埠医学院第二附属医院,安徽蚌埠 233000

人胶质瘤干细胞(GSCs)是一群具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的肿瘤细胞，表达神经干细胞表型CD133，常常集中存在于肿瘤坏死区周边、微血管周围以及肿瘤边缘等胶质瘤常发生侵袭播散的部位。GSCs向远处的侵袭播散，是恶性胶质瘤复发及无法根治的重要原因[1～3]。我们前期研究[4，5]发现，Notch1信号通路活化的GSCs侵袭迁移能力更强，Notch1信号通路活化后可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导调节GSCs的侵袭迁移。马健会发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路能够反向调控Notch1信号通路的表达。可见，Notch通路与PI3K/Akt/mTOR信号通路具有交互作用，抑制其中1条信号通路无法很好的起到抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的作用；在急性淋巴细胞白血病中，单独应用Notch信号通路抑制剂可导致PI3K/Akt/mTOR信号通路活性增加，使肿瘤细胞对Notch信号通路抑制剂产生耐受，单独应用PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂也会引起Notch信号通路活化，使肿瘤细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂产生耐受[6]。联合应用Notch1信号通路及PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂或许能够减少GSCs的侵袭迁移能力，达到更好的治疗效果，为胶质瘤的治疗提供新思路。2020年1～2月，我们观察了联合应用Notch1信号通路抑制剂(DAPT)和PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂(PI-103)对GSCs侵袭、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人胶质瘤U87细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。DAPT和PI-103,DMEM、DMEM/F12培养基,B27,表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),CD133、nestin、Hes1抗体,pmTOR(Ser2448)抗体,小鼠抗人GAPDH抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊二抗。Transwell小室,Matrigel基质胶。

1.2 GSCs的获取及鉴定 取U87细胞置于干细胞培养基中培养，由DMEM/F12(1∶1)培养基、EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)以及B-27(1∶50)配置。待形成悬浮生长的干细胞球后，使用1.25 g/L胰蛋白酶和2 mmol/L的乙二胺四乙酸常规消化、漂洗细胞。利用CD133免疫磁珠细胞分离试剂盒分离细胞，将收集的CD133+和CD133-的细胞重悬置于无血清干细胞培养基中进行培养。培养条件为室温37 ℃、饱和湿度、5%CO2。取培养获得的第3代细胞球，免疫荧光染色后免疫荧光激光共聚焦显微镜下观察到，获得细胞球中神经干细胞标志物CD133与nestin阳性表达，说明GSCs分选成功。

1.3 GSCs分组、DAPT和PI-103处理方法 取GSCs细胞，分为DAPT处理组(A组)、PI-103处理组(B组)、DAPT和PI-103 共同处理组(C组)、药物溶媒对照组(D组),A组加入20 μmol/L的DAPT培养，B组加入4 μmol/L的PI-103培养，C组加入20 μmol/L的DAPT+4 μmol/L的PI-103共培养，对照组不作任何处理。

1.4 各组细胞Notch1活化标志物(HES1、pmTOR蛋白)检测 采用Western blotting法。在干细胞培养基中悬浮培养各组细胞,成熟后收集各组细胞，提取总蛋白，-80 ℃保存。取各处理组的总蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴下以80V电压转至醋酸纤维素膜(PVDF膜)，时间为90 min。PBST缓冲液洗膜3次，脱脂奶粉封闭2 h。剪膜后加入不同一抗后4 ℃孵育过夜，兔抗人Notch1抗体、兔抗人HES1抗体、兔抗人Akt抗体、兔抗人pAkt抗体、兔抗人mTOR抗体以及兔抗人pmTOR抗体的稀释比例均为1∶1 000。次日复温清洗后加入对应二抗室温孵育1 h。使用凝胶成像分析系统采集条带结果，使用Image J软件对条带进行量化分析，分析特异性条带的光密度值，作为目的蛋白相对表达量。

1.5 各组细胞侵袭、迁移能力观察 采用Transwell侵袭实验。将Transwell小室加在24孔板上，取60 μL matrigel胶均匀铺在小室上室，37 ℃温箱内预置60 min。上室每孔加100 μL约含有2×104个细胞的无血清细胞悬液，下室中加500 μL的10%胎牛血清的DMEM。放入培养箱培养12 h后，将小室取出，弃掉上室内的培养基，4%多聚甲醛固定5 min，结晶紫染色后，随机选择5个视野，100倍倒置显微镜下观察并拍照，计算穿过膜的细胞数。Transwell迁移实验不铺matrigel胶，其余同Transwell侵袭实验。均重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组Hes1、pmTOR蛋白相对表达量比较 A、B、C、D组Hes1蛋白相对表达量分别为0.77±0.07、0.41±0.04、0.40±0.03、0.78±0.06，pmTOR蛋白相对表达量分别为0.31±0.02、0.33±0.02、0.19±0.01、0.62±0.05;与D组和A处理组相比，B、C组Hes1的蛋白相对表达量降低(P均<0.01)；与D组相比，A、B、C组pmTOR蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；与A、B组比较，C组pmTOR蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。

2.2 各组侵袭、迁移穿膜细胞数比较 A、B、C、D组侵袭穿膜细胞数分别22.35±6.75、26.87±6.91、8.21±3.53、61.63±10.87，A、B、C、D组迁移穿膜细胞数分别为23.18±6.56、25.09±6.73、8.78±3.67、63.25±11.03;与D组相比，A、B、C组侵袭、迁移穿膜细胞数降低(P均<0.05)；与A、B组比较，C组侵袭、迁移穿膜细胞数降低(P均<0.05)。

3 讨论

Notch信号通路在人脑肿瘤中处于异常激活状态，起着维持GSCs的自我更新、促进其增殖、抑制其分化的作用[7，8]。PI3K/Akt/mTOR信号通路在胶质母细胞瘤和GSCs中亦处于高度激活状态，是调节肿瘤细胞侵袭迁移的重要信号通路[9，10]。前期我们通过对Notch1信号通路进行研究发现，随胶质瘤恶性级别升高，Notch1活化标志物Hes1表达也随之升高；在GSCs中Notch1信号通路处于高度活化状态，且使用DAPT抑制Notch1通路活性后，PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性降低，胶质瘤干细胞的侵袭迁移能力下降[4，5]，表明Notch1通路经PI3K/Akt/mTOR信号通路调解胶质瘤干细胞的侵袭迁移。但Notch通路与PI3K/Akt/mTOR信号通路具有交互作用，单一的抑制其中一条信号通路无法很好的起到抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的作用；因此，联合应用两种通路抑制剂或许能够达到降低GSCs侵袭迁移能力的目的，取得更好的治疗效果，为恶性胶质瘤的治疗提供新思路。

本实验通过免疫磁珠分选法在U87胶质瘤细胞系中分离出CD133+表达的细胞，在体外对其进行培养，成功获得可连续传代的GSCs。本研究将GSCs分为4组， DAPT为γ分泌酶抑制剂，能够有效的抑制Notch1信号通路的活化，为Notch1通路特异性抑制剂[11,12]，PI-103为P13K/mTOR双靶点小分子抑制剂，可以特异性抑制P13K 和mTOR活性，且不会因信号反馈而使Akt激活，其抑制效果明显优于其它抑制剂[13，14]。本研究发现，A组Hes1相对表达量明显降低，表明Notch1信号通路得到有效的抑制;B组的pmTOR相对表达量明显降低，表明PI3K/Akt/mTOR信号通路得到有效的抑制;C组Hes1和pmTOR蛋白表达明显降低，表明Notch1信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路均得到有效的抑制；C组pmTOR蛋白表达明显低于A、B组，结合我们前期研究Notch1信号通路经PI3K/Akt/mTOR信号通路调节GSCs的侵袭迁移能力，推测通过联合抑制Notch1信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路可以进一步降低GSCs的侵袭迁移能力。本研究还发现,与D组相比，A、B、C组的迁移和侵袭能力下降，表明通过分别抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路、Notch1信号通路、联合抑制Notch1信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路均可以使GSCs的侵袭、迁移能力降低；其中A、B组穿过小室聚碳酸酯膜的平均每个视野细胞数目明显高于C组，表明通过联合抑制Notch1信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路使GSCs的侵袭迁移能力进一步下降。

总之，联合抑制Notch1信号通路和PI3K/Akt/mTOR信号通路能够显著降低GSCs侵袭、迁移能力。