转移性结直肠癌抗EGFR治疗的耐药机制研究进展

陈秀琼，孟凡桥，熊 华，周洋媚，唐雯华，邹燕梅

(华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心，湖北 武汉 430030)

结直肠癌在人类恶性肿瘤中发病率排名第3，是癌症相关性死亡的主要原因之一[1]。近年来，通过不断挖掘转移性结直肠癌发生发展的分子机制，在治疗转移性结直肠癌方面取得了重大进展，患者的总体生存期从氟嘧啶单药治疗时期的约1年增加到化疗联合靶向治疗的30个月以上，尤其是携带野生型鼠类肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)的患者[2]。目前，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南已推荐抗EGFR治疗联合化疗作为携带野生型RAS基因患者的标准治疗方案。西妥昔单抗与帕尼单抗作为两种抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体，显著改善携带野生型RAS基因患者的生存预后。然而，大多最初抗EGFR治疗敏感的患者，最终也会在治疗后15个月左右产生耐药[3]。

EGFR是一类属于ERBB家族的跨膜受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)，可启动多种细胞内信号通路，促进癌细胞增殖、抑制凋亡、侵袭、转移和刺激新生血管形成。西妥昔单抗和帕尼单抗可以结合到EGFR的细胞外结构域，从而阻止酪氨酸激酶以及与细胞存活、增殖、转移，以及血管发生相关的多重下游信号传导级联反应的激活。EGFR激活的主要下游通路(RAS-RAF-MAPK，PI3K-PTEN-AKT和JAK/STAT)与抗体介导的EGFR抑制的耐药机制具有重要的关联。任何一个环节的改变都可导致EGFR激活和下游的细胞信号传导，从而导致耐药[4]。结直肠癌抗EGFR治疗的耐药机制主要包括原发性和继发性耐药。

1 原发性耐药

1.1 EGFR和EGFR配体的改变

近年来，随着对EGFR研究的深入，EGFR基因拷贝数及EGFR配体的水平与EGFR抑制剂疗效之间的关系也被逐渐挖掘。EGFR改变导致原发耐药的原因包括较低的EGFR基因拷贝数以及低表达的EGFR特异性配体。

1.1.1 EGFR基因低拷贝数EGFR表达与靶向药物疗效之间的关联已在多种肿瘤中得到证实，人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)高表达的胃癌及乳腺癌患者使用曲妥珠单抗(商品名：赫赛汀)治疗可带来生存获益。在2002年，Vogel等人的一项研究首次证实，对于HER2过表达的转移性乳腺癌患者，单药曲妥珠单抗可作为一线治疗方案。类似的结果在HER2过表达的转移性胃癌患者中也被观察到[5-6]。随着研究的深入，EGFR突变在肺癌中的研究已逐渐成熟并广泛应用于临床，EGFR突变的患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂有良好的临床反应。但EGFR突变在结直肠癌中罕见，关于这方面的研究甚少，大多研究集中于EGFR基因拷贝数方面。在一项检验EGFR基因拷贝数和抗EGFR治疗临床反应相关性的队列分析中[7]，用PCR定量技术测得患者的EGFR拷贝数，结果显示约90%的西妥昔单抗或帕尼单抗治疗后客观有效的患者表现出EGFR高拷贝数，无法从抗EGFR治疗中获益的患者表现出EGFR基因低拷贝数，提示EGFR基因低拷贝数可能与抗EGFR治疗的原发耐药相关。随后，Algars等人对EGFR基因拷贝数和RAS状态对转移性结直肠癌预后的影响进行了研究，结果显示，EGFR基因拷贝数＞4.0的携带野生型RAS基因的患者能在抗EGFR治疗中获益最大而EGFR拷贝数＜4.0的携带野生型RAS基因的患者与RAS突变型患者的预后类似，无法从抗EGFR治疗中获益[8]。因此，EGFR拷贝数的改变可能是抗EGFR治疗耐药产生的机制之一。

1.1.2 AREG和EREG的低表达上皮细胞生长因子双调蛋白(amphiregulin，AREG)和表皮调节素(epiregulin，EREG)是 EGFR的特异性配体，通过与受体结合在细胞内起信号转导作用。基因表达谱显示，AREG和EREG高表达的患者更有可能对西妥昔单抗产生反应。一项纳入220例转移性结直肠癌患者使用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的前瞻性研究，根据实体瘤疗效评价标准评估RAS及EGFR配体状态，将患者分为RAS野生型，RAS突变型，配体高表达的RAS野生型，配体低表达的RAS野生型。结果表明，AREG和EREG高表达的RAS野生型患者的OS与PFS明显延长(P＜0.05)，而低表达的RAS野生型患者与RAS突变型患者的预后类似[9]。之后的一项meta分析将有关AREG和EREG与转移性结直肠癌患者抗EGFR治疗疗效相关的研究进行了系统分析，结果提示，在接受抗EGFR治疗的RAS野生型患者中，AREG和EREG高表达与较长的OS相关，这些配体的表达可作为评估接受抗EGFR治疗的携带野生型RAS基因患者预后的标准之一[10]。实际上，AREG和EREG的表达是通过EGFR产生的自分泌循环，从而在肿瘤的生长和存活中发挥重要作用。因此AREG和EREG的低水平表达特别容易发展为EGFR抑制剂耐药。

1.2 RAS突变

编码鸟苷-5"-三磷酸(guanosine priphosphate，GTP)结合蛋白的RAS家族基因(包括KRAS、NRAS和HRAS)在EGFR激活相关的信号通路中起重要作用。约50%的结直肠癌(colorectal cancer，CRC)患者可检测到RAS突变，其中KRAS突变占40%，NRAS突变占3%～5%，HRAS突变非常少见。RAS基因突变会导致RAS下游效应物通路的激活，RAS突变在抗EGFR治疗的原发性耐药中起主要作用。

1.2.1 KRAS基因外显子2突变在CRC中，约85%～90%的KRAS突变发生在外显子2(密码子12和13)上。KRAS外显子2突变是迄今为止在mCRC患者中应用抗EGFR抗体耐药性的最常见的预测指征，并且已被用于临床实践中。在接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗前，所有 CRC患者现在都被强制要求测试KRAS密码子12和13中的7个突变。然而对于密码子13突变在抗EGFR治疗的原发性耐药中的作用仍存在争议。研究表明携带KRASG13D突变的患者可能会从西妥昔单抗治疗中获益[11]，且KRASG13D突变患者与拥有其他KRAS突变的患者相比，获得了更长的总生存时间(overall survival，OS)和无进展生存时间(progression free survival，PFS)(OS分别为7.6和5.7月，HR=0.50，P=0.004；PFS分别为4.0和1.9月，HR=0.51，P=0.005)。提示KRAS G13D突变患者可能受益于西妥昔单抗治疗。然而，近期的两项回顾性分析显示携带KRAS G13D突变和携带其他KRAS突变的患者在OS和PFS方面并没有显著的差异(OS分别为8.2和14.6月，HR=0.50，P=0.084；PFS分别为4.96和3.1月，HR=0.88，P=0.72)[12]。因此，KRAS G13D突变在抗EGFR治疗的原发性耐药中的作用仍存在争议。

1.2.2 其他RAS突变近年来，研究表明其他RAS家族基因(KRAS外显子3和4；NRAS外显子2，3和4)的改变也与抗EGFR治疗反应呈负相关[13]。对PRIME试验数据的亚组分析显示：如果发生超出KRAS 2号外显子的突变，预示着帕尼单抗联合一线化疗药的治疗将缺乏良好的效益[14]，在此研究中Doulliard等人证实了在具有包括KRAS外显子3(密码子61)或4(密码子117和146)或NRAS外显子2(密码子12和13)，3(密码子61)或4(密码子117和146)等突变的肿瘤患者中运用FOLOFX4联合帕尼单抗方案治疗在PFS和OS上的负面作用。CRYSTAL研究分析发现约15%KRAS 2号外显子野生型的患者拥有其他RAS突变。从PFS(分别为7.2和6.9月，HR=0.81，P=0.56)和OS(分别为18.2和20.7月，HR=1.22，P=0.50)可以看出，这些RAS的扩展突变与对西妥昔单抗的较差反应性相关。因此，类似于KRAS外显子2突变，其他的RAS突变也可能在mCRC患者对于抗EGFR治疗的耐药中起重要作用。

1.3 BRAF突变

并不是所有RAS野生型患者均对抗EGFR治疗反应良好。EGFR信号网络下游组件其他分子的改变也可能与抗EGFR单抗耐药相关联，鼠肉瘤病毒癌基因同源体B(V-raf murine sarcoma viraloncogene homolog B，BRAF)是EGFR通路中RAS的下游效应器，约5%～9%的CRC患者携带BRAF V600E等位基因突变，多项研究均表明无论有无EGFR阻断，BRAF V600E的突变仍然可以导致持续性下游信号通路的激活从而导致细胞增殖或存活[15-16]。一项来自7个欧洲国家的11个中心的回顾性临床资料分析了BRAF突变对化疗难治性mCRC患者使用西妥昔单抗联合化疗的疗效的影响。结果显示BRAF V600E突变患者与野生型肿瘤患者相比，表现出显著降低的反应率(分别为8.3%和38.0%，OR=0.15，P=0.001 2)[17]。以上研究表明，在mCRC中BRAF V600E的突变和抗EGFR治疗的耐药有着明显的因果关系，类似于KRAS，BRAF V600E突变也可以用于识别无法对抗EGFR治疗产生反应的患者。此外，BRAF突变仅限于不携带RAS突变的肿瘤。所以在使用抗EGFR治疗前，充分考虑肿瘤中是否存在BRAF和RAS突变可以帮助确定至少一半的治疗无应答者。

1.4 PIK3CA/PTEN信号通路的激活

除RAS/RAF轴外，EGFR也触发PIK3CA/PTEN信号通路[18]。PIK3CA/PTEN通路的分子改变，包括磷脂酰肌醇-3-羟激酶催化亚基α(phosphatidyl inositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)基因的突变或张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deletedonchromosometen，PTEN)表达的丧失，均可通过与EGFR无关的机制导致下游信号通路激活。因此，PIK3CA/PTEN信号通路激活在EGFR抑制耐药的进展中的作用值得探索。

1.4.1 PIK3CA外显子20突变PIK3CA是I型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的催化亚单位，编码p110a蛋白激酶，p110a蛋白激酶是一个EGFR的下游效应物。PIK3CA突变导致p110a蛋白激酶及其下游信号通路的构成型激活，从而引起肿瘤细胞增殖和存活。80%的PIK3CA突变出现在外显子9(E542K，E545K)或外显子20(H1047R)上。然而，生化研究显示PIK3CA外显子9和外显子20中的突变有不同的效果。外显子9突变通过RAS-GTP结合引发增益功能，而外显子20突变却与RAS-GTP的相互作用无关[19]。目前，已有多项研究开展用于解决以上结果不一致的矛盾。一项回顾性研究以西妥昔单抗治疗为基础，发现在KRAS野生型背景下，携带PIK3CA外显子20突变的患者显示出比野生型PIK3CA患者明显较低的反应率[分别为0和36.8%；95%CI(0.00，0.89)；P=0.029]，而在外显子9突变的患者中没有显著差异[分别为28.6%和36.3%；95%CI(0.25，1.78)；P=0.47][20]。而另一项包含13个回顾性研究的荟萃分析得出这样的结论：只有PIK3CA外显子20突变与抗EGFR治疗的无反应有关[21]。总之，PIK3CA外显子9突变和外显子20突变在抗EGFR治疗疗效方面有着不同的预测能力。PIK3CA外显子20突变与抗EGFR的耐药相关性更大一些。

1.4.2 PTEN缺失PTEN作为肿瘤抑制基因，负性调节PI3KAKT信号通路。PTEN基因丧失造成PI3K-AKT信号通路的组成型激活，促使肿瘤细胞的增殖和存活。在乳腺癌患者中，PTEN蛋白丧失的患者对抗HER2治疗的疗效较差[22]，但是，在CRC中，PTEN缺失的作用仍然不确定。Sartore-Bianchi等人在2009年指出，在110名用抗EGFR单抗治疗的患者中，PTEN缺失与药物反应率，PFS和OS降低有关[23]。另一项研究表明PTEN表达缺失的数据在肿瘤原发灶和转移灶之间并不完全一致[24]，在该研究中，22例转移灶PTEN表达阴性(通过免疫组化得方法检测)患者中只有1例(5%)对西妥昔单抗治疗有反应，而33例转移灶PTEN阳性的患者中有12例(36%)产生了部分应答[OR=12.00；95%CI(1.43，100.75)；P=0.007]。但是，在肿瘤原发灶中，根据PTEN的表达情况分类，并未观察到有显著差异。因此，将PTEN表达的丧失作为预测抗EGFR治疗效的生物标志物仍存在较大争议。

1.5 JAK/STAT信号通路过度激活

酪氨酸激酶的Janus家族(Januskinase，JAK)和信号转导激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族是参与细胞存活、增殖、分化和凋亡的调节的重要分子。JAK家族通过自分泌和旁分泌产生细胞因子，同时激活酪氨酸激酶，如EGFR和Src激酶(Src kinase，SRC)，导致STAT3持续激活，从而在肿瘤发生、血管生成、侵袭、转移和免疫系统抑制中发挥重要作用。吉非替尼是一种EGFR抑制剂，一项研究发现在CRC细胞中，STAT3磷酸化(pSTAT3)与吉非替尼耐药性有高度相关性[25]。此外，另一项研究也获得了类似的结果，证实吉非替尼与一种JAK/STAT3通路抑制剂-葫芦素B联合治疗，可能增强其抗肿瘤活性。因此，将EGFR与JAK/STAT3信号传导同时抑制，比单一途径的抑制更加有效[26]。这些发现表明JAK/STAT3途径可能有助于CRC中EGFR抑制剂的耐药。

1.6 上皮间质转化

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种复杂的生理过程，在此过程中，上皮细胞程序性丧失其原始形态并同时获得间充质特征。EMT增强了细胞的侵袭潜力，并导致许多癌症相关事件的发生，包括癌症侵袭，转移和药物耐药。以往的研究表明，发生在癌细胞中的EMT样转化减弱了EGFR信号在调节细胞增殖和生存中的作用。一项临床前研究观察到CRC细胞中E-钙粘蛋白(上皮标记物)的表达和EGFR抑制剂的作用具有显著相关性[27]，且间质样CRC细胞对于抗EGFR药物的耐药性可以通过EGFR抑制剂和畸胎瘤衍化生长因子单克隆抗体(Cripto)抑制剂的联合使用来消除，其中Cripto是引发EMT的重要信号节点。总的来说，大量的数据显示，在CRC细胞中，EMT可能在抗EGFR药物的耐药产生中发挥着重要的媒介作用。

2 继发性耐药

临床资料显示，绝大多数接受抗EGFR治疗的CRC患者，在3～12个月时间内将出现疾病进展[28]，提示继发性耐药，许多机制可能在抗EGFR治疗的继发耐药中发挥重要作用。

2.1 RAS/RAF基因的继发突变

RAS/RAF信号轴是EGFR下游最重要的信号通路之一，其在抗EGFR治疗的原发性耐药形成中的作用已被广泛认可。事实上，RAS/RAF信号通路中的基因改变也是引起继发性耐药最常见的分子机制。2010年，Bouchahda等人报道了一例对西妥昔单抗耐药的CRC肝转移的病例。在这个病例中，在西妥昔单抗治疗开始之前，在肿瘤原发或转移灶样品中并未检测到KRAS突变。但是，在西妥昔单抗治疗之后，在异时肝转移组织中检测到了位于13和12密码子的2个KRAS突变[29]。Misale等人随后进行了一个相似的研究，他们分析了复发性CRC患者的分子特征[30]。10例KRAS野生型患者在接受西妥昔单抗治疗后，有6例的血浆样品中检出了KRAS突变，然而，在单独接受化疗的患者中并未发现KRAS突变。这种RAS/RAF信号通路中“获得性遗传改变”的出现提出了一个问题：这些改变是新的自发突变还是来自原本存在的抗EGFR治疗的耐药基因的亚克隆。研究结果更支持后者，即KRAS的“获得性”改变可能是在抗EGFR单抗的筛选下形成的预先存在的耐药基因的克隆。因此，RAS和BRAF基因的继发突变被确定为CRC治疗中产生继发性耐药的一种机制。

2.2 选择性生长因子受体旁路的激活

获得性耐药的另一个主要机制是通过激活EGFR以外的选择性和补偿性的信号级联通路。许多生长因子受体，如1型胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)，间充质-上皮转换因子受体(mesenchymal-epithelial transition，MET)和HER2等都可以绕过EGFR通路激活EGFR下游效应器并引发随后的细胞内信号传导，从而诱导肿瘤细胞增殖和抵抗凋亡。

2.2.1 IGF-1R通路的激活IGF-1R属于跨膜酪氨酸激酶家族受体中的一员并表达于多种类型的细胞表面，IGF-1R激活依赖于胰岛素样生长因子(IGF)1或IGF-2的结合，从而导致下游RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT通路的激活。一项临床前研究显示IGF-1R及其配体(IGF-1/IGF-2)在CRC抗EGFR治疗获得性耐药中具有一定作用[31-32]，根据伊立替康和西妥昔单抗治疗后的临床结果评估显示：与IGF-1阴性组相比，IGF-1阳性组中观察到了较低的反应率[分别为22%和65%；HR=4.2；95%CI(2.0，10.2)；P=0.003]。显著的统计学差异表明IGF-1R通路异常的激活可能与抗EGFR治疗的耐药性相关。

2.2.2 MET过表达和扩增MET癌基因是编码肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)的酪氨酸激酶受体，α-转化生长因子(transforming growth factorα，TGF-α)过表达激活的MET通路与EGFR-MET之间的相互作用被认为是产生获得性耐药的可能机制之一。对具有西妥昔单抗或帕尼单抗耐药性的患者的肿瘤组织进行分析，结果显示40%以上病例出现MET基因的扩增[33]。MET扩增的出现与CRC中抗EGFR治疗获得性耐药是相关的，然而，MET扩增也在抗EGFR单抗的原发性耐药中有一定贡献。

2.2.3 HER2扩增和HER3/4配体蛋白的过表达HER2是受体酪氨酸激酶HER家族的成员，HER2与EGFR或HER3的异源二聚体化激活MAPK和PI3K/AKT通路[34]，因此HER2是抗EGFR治疗耐药的潜在生物标志物。靶向HER2和EGFR抑制剂的联合应用能够显著抑制西妥昔单抗耐药CRC细胞的生长。实际上，HER2扩增既是CRC获得性的耐药机制，也是其原发耐药性机制。

2.3 EGFR S492R突变

S492R是EGFR的一种细胞外区域结构，EGFR-S492R的突变被证实与mCRC西妥昔单抗的获得性耐药相关。EGFR胞外区域结构的突变，包括1476C＞A或1474A＞C碱基置换，导致氨基酸492(S492R)位点的丝氨酸与精氨酸的置换[35]。这种突变降低了受体对配体的亲和力，干扰了与西妥昔单抗的结合。提示S492R突变是西妥昔单抗获得性耐药的一种机制。

2.4 VEGF信号的改变

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在血管生成中起着核心作用的重要信号分子。结肠癌细胞中VEGF表达升高与EGFR抑制剂的耐药相关。与西妥昔单抗敏感细胞相比，在西妥昔单抗耐药细胞中VEGF以及VEGFR1有较高水平的表达[36]。VEGFR和EGFR抑制剂的联合应用可以引起细胞对抗EGFR药物敏感性的恢复，进一步支持了VEGF/VEGFR1过表达与抗EGFR治疗耐药之间的关系。然而，也有研究表明在抗EGFR和抗VEGF之间存在潜在的负性药理学作用，即抗EGFR治疗的使用减弱抗VEGF治疗的疗效。两者的联合无法给患者带来生存获益。因此，VEGF信号通路在抗EGFR治疗耐药中的作用需要进一步更深入的研究。

3 总结

综上所述，抗EGFR单抗耐药的主要机制是通过EGFR下游的信号级联通路的异常激活产生的，包括RAS/RAF、PIK3CA/PTEN和JAK/STAT通路成员基因的改变，以及选择性生长因子受体旁路，如IGF1R、HER2和MET的激活。这些主要耐药机制可以解释70%以上结直肠癌抗EGFR治疗无效的病例。目前只有RAS突变被批准用于临床实践中，RAS突变的结直肠癌患者无法从抗EGFR治疗中获益。因此，为了探究其他生物标志物是否能有效地应用于临床，需要更多临床试验进行探索。同时需要更深层次地明确抗EGFR单抗耐药机制，将有助于制定新的治疗策略从而克服抗EGFR治疗的原发性和获得性耐药。