移植细胞实现肝脏有效再殖的机制研究

阎 琛，刘清桂，陈佳佳，孙 宇，杨 桃，朱海英，陈 费，王敏君

(第二军医大学细胞生物学教研室，上海 200433)

原位肝移植是目前公认的治疗肝衰竭等终末期肝病最为有效的方法，但是因供体肝脏紧缺，免疫排斥，高额费用等缺陷往往限制了其在临床上的推广与应用。如今，细胞移植被认为是原位肝移植在临床治疗上的替代方案，以其手术创伤小，低免疫排斥，可塑性高和可重复性高，成本低等优点，为肝衰竭等终末期肝病开辟了崭新途径。移植的细胞再殖肝脏后可缓解肝功能持续衰竭并可促进自身肝细胞的更替和再生，可为患者获得原位肝移植提供等待机会或者可直接代替肝移植而治疗肝脏疾病。而细胞移植治疗取得疗效的金标准是实现肝脏再殖。肝脏再殖是移植的外源细胞及其所增殖的子代细胞参与损伤肝脏结构的修复并正常发挥肝细胞生理功能。但是研究显示肝细胞移植后，其移植细胞在肝脏的再殖效率往往不足2%[1]，这样的再殖效率无法满足整个肝功能发挥的需求，极大地限制了其在临床上的广泛应用。肝脏再殖的两大关键因素是供体细胞有效地植入受体肝脏以及植入宿主肝脏后细胞的快速增殖。大量研究已经表明，当赋予供体细胞比宿主细胞更强的生长或生存优势时，肝细胞就可以有效地再殖肝脏并恢复肝细胞功能。在动物模型实验的移植试验中，基于选择性优势的肝细胞再殖的传统性策略主要有两个：一是抑制受体肝细胞使其不能通过自身增殖来恢复肝细胞功能，二是赋予供体肝细胞更强的生长或生存优势来促进其再殖。然而，近年来也有研究显示，在非选择性优势下，细胞移植后也可以实现肝脏的再殖[2]。更为重要的是，宿主肝细胞损伤和外源细胞的移植会改变肝脏微环境，引起微环境中相关因子如炎症因子白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的表达，是移植细胞实现肝脏再殖的另一个重要机制[3-5]。因此，本文主要揭示动物模型中成功完成肝脏再殖实现正常肝功能的模型构建机制，为临床上终末性肝脏疾病细胞治疗策略的推广和应用提供可行的思路。

1 选择性优势促进肝脏再殖

选择性优势是指相较于宿主肝细胞，移植细胞具有更强的生长和生存优势。大量实验表明，当赋予移植细胞更强的生长或生存优势时，植入细胞就可以快速增殖并实现肝脏有效再殖。而选择性优势实现肝脏有效再殖需要具备以下2个条件：①相较于内源性宿主细胞，移植肝细胞必须获得较强的增殖或生存优势；②急性或慢性肝脏损伤导致内源性细胞的清除或功能丧失为移植细胞在宿主肝脏的再殖提供足够的增殖动力和空间。

1.1 宿主肝细胞先天功能异常或增殖抑制是细胞再殖的先决条件

肝细胞占肝组织细胞的比重高达70%，作为肝脏功能的主要承担者，发挥糖原合成、脂质代谢、分泌胆汁等功能。而肝细胞功能异常或缺失则会引起肝脏器官机能的异常从而导致肝脏疾病如肝纤维化、肝硬化甚至急性或慢性肝脏衰竭的发生，因此机体急需外源细胞来替代宿主肝细胞而发挥正常的肝脏功能，为移植细胞成功再殖受体肝脏提供了优势。尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子(urokinase plasminogen activator，uPA)转基因动物模型和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetatehydrolase，Fah)基因敲除模型是宿主代谢功能异常而促进移植细胞再殖肝脏的经典模型。在uPA动物模型中，肝细胞过表达uPA会导致肝脏凝血功能障碍从而引发肝损伤。当野生型肝细胞或肝前体细胞移植入uPA受体小鼠肝脏后，移植细胞可在宿主肝脏中增殖并替换功能缺陷的宿主肝脏从而完成对宿主肝脏的再殖，其肝脏重构效率可以达到80%以上[6-7]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除模型模拟了临床上Ⅰ型酪氨酸血症，由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶的缺乏，酪氨酸分解代谢受阻，无法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸盐，而使得毒性次级代谢产物的蓄积，引起肝脏严重损伤。100个正常的移植肝细胞在受体肝脏中就能重建出整个肝脏5%的细胞，约2×105个细胞，并重建肝小叶的结构与功能[8]。FAH小鼠肝脏损伤的模型不仅已成功实现了成熟肝细胞的肝脏再殖和肝酶代谢异常的纠正，该模型已经成为了检验移植细胞是否能够转化并具备成熟肝细胞功能的一种标准。目前，非成熟肝细胞如肝前体细胞、重编程诱导的肝干细胞、3D类器官等的肝脏再殖都在FAH小鼠模型上成功实现[9-10]。Markus Grompe课题组还新发现小分子抑制剂CEHPOBA可以模拟FAH酶的缺陷功能，同样引起肝脏功能损伤而为细胞移植的再殖奠定了基础[11]。

uPA小鼠和FAH小鼠模型是最早构建、应用最广、最为经典的肝脏再殖模型，随着该领域研究的不断深入，越来越多的再殖模型逐渐建立。例如，LEC大鼠和Atp7b-/-小鼠也是一种代谢缺陷为前提的细胞再殖模型，主要模拟临床上的Wilson病。该模型是由于编码铜转运的ATP7b基因突变，一方面降低血清中铜蓝蛋白含量，另一方面又减少铜从胆汁排泄，使得铜贮留在肝细胞内从而造成肝细胞凋亡坏死。研究表明将间充质干细胞移植进入LEC大鼠模型中，肝功能得到显著恢复[12]。PiZ小鼠是模拟临床上α-1抗胰蛋白酶缺乏症的动物模型，该模型是由于高表达人源性的编码α-1抗胰蛋白酶的突变基因PiZ，使得其编码的外源性Z-ATT蛋白聚合物沉积在小鼠肝细胞内质网中，导致肝细胞不断的死亡与再生，为供体肝细胞的移植提供了选择性优势。实验证明将正常的人源性肝细胞或基因校正过的小鼠肝细胞移植进受体肝脏，血清中的胰蛋白酶水平得到了大幅度降低，肝脏功能明显恢复[13]。D-半乳糖胺(D-galactosamine)是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，可造成肝弥漫性坏死和炎症，模拟临床病毒性肝炎。其损伤机理是半乳糖胺能竞争性结合尿苷三磷酸，使得核酸、糖蛋白、脂糖等物质合成受抑制，限制了细胞器及酶的生成和补充，细胞器受损。而小动物、大动物以及临床病人的间充质干细胞移植研究都表明体外移植的细胞可以改善肝功能异常并能够再殖到宿主肝脏[14]。对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导急性肝功能衰竭模型主要由于肝细胞代谢APAP产生的代谢产物具有氧化毒性，使得生物膜发生脂质过氧化而导致肝细胞变性坏死。进行肝细胞或者干细胞移植后可以明显缓解肝功能异常的现象[15]。然而急性肝衰竭模型的再殖研究显示移植细胞再殖损伤肝脏的效率非常低，可能跟宿主肝脏没有多余的空间给移植细胞增殖相关。进行性的肝脏纤维化是由于肝脏对于慢性损伤不断地做出修复反应，导致肝再生小结节周围胶原纤维的累积，实质细胞被瘢痕组织所取代，从而造成肝功能的损伤。将肝细胞移植进入由硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)诱导的肝纤维化模型中，肝细胞可以成功再殖宿主肝脏并能够取代原来纤维化的组织进而实现损伤肝脏的修复[16]。

正常生理条件下，成熟的肝细胞一般处于静息状态(G0期)，更替周期长达200～300 d，几乎检测不到增殖的肝细胞。但是一旦肝脏遭受到损伤或刺激，这些静息的肝细胞可以发挥强大的增殖能力，快速进行代偿反应，重新进入细胞周期，实现细胞增殖。然而当宿主肝细胞增殖被抑制，为外源肝细胞在损伤肝脏刺激下的再殖提供增殖优势。倒千里光碱属于吡咯里西啶生物碱家族，可以特异性被肝脏摄取，其代谢的毒性中间产物可以使DNA烷基化，从而特异性地抑制细胞周期G2/M期。在倒千里光碱和四氯化碳肝损伤的刺激下，移植细胞植入受体肝脏后可以快速进行增殖并修复受损的肝功能[17]。与此同时，研究发现将肝细胞移植进入倒千里光碱预处理的肝脏还有助于急慢性胆管损伤的再生与修复[18]。与倒千里光碱属于同一家族的野百合碱，同样具有抑制宿主肝细胞增殖的功能，为供体肝细胞再殖肝脏创造了条件[19]。然而，研究还发现生物碱诱导的再殖模型对于移植细胞发展成肝细胞癌有着一定的促进作用[3]。此外，受到X射线辐射的肝细胞会发生自由基介导的DNA氧化损伤，从而造成增殖能力的受损，并且在给予宿主肝脏缺血再灌注、肝叶切除、甲状腺素T3、生长因子等增殖刺激后移植细胞也都能够有效再殖受体肝脏[20-21]。尽管辐射是一种非侵入性、易行性好、安全性高的肝脏再殖手段，但是辐射诱发的胃肠综合征和动脉粥样硬化是该再殖模型潜在的不良反应，因此如何在靶向照射减少并发症的同时达到抑制宿主肝细胞增殖的效果是目前临床上有待进一步解决的问题。

细胞衰老主要表现为细胞永久性增殖阻滞，细胞生理功能降低，同时伴随衰老相关蛋白的异常表达。研究显示倒千里光碱、辐照结合2/3肝切除不仅抑制了宿主肝细胞的增殖，并且还诱发宿主肝细胞的衰老[3，22]，为移植细胞的再殖创造了前提条件。值得注意的是，考虑到倒千里光碱的促癌效应以及辐射作为化疗方式，辐照结合肝切诱导宿主肝细胞衰老则是更加安全的方式。当相同数量的年轻和衰老肝细胞同时移植入受体肝脏后，年轻供体肝细胞具有明显的增殖优势[23]。相反，年轻供体细胞移植入年轻和老年受体肝脏后，老年受体中肝细胞再殖的效率要明显高于年轻受体[24]。这些都表明了肝细胞的衰老能够为细胞的再殖提供竞争性的生长优势，诱导细胞发生衰老是一种全新的基于选择性优势的移植策略。Mdm2是一种E3泛素蛋白连接酶，主要参与p53蛋白的降解。Mdm2基因的缺失，导致p53蛋白表达水平增高，抑制了细胞增殖而诱发肝细胞发生衰老。在Mdm2特异性敲除模型中，肝前体细胞不仅被活化增殖，而且还分化成有功能的肝实质细胞，替换了衰老的肝细胞而重构肝脏结构完成肝功能的修复[25]。研究还发现，Fah基因的缺失也会诱导受体肝细胞发生衰老，而且衰老肝细胞还会进一步促进肝实质结构松散，在增殖能力和空间上都为供体细胞的再殖提供了有利条件[26]。

1.2 移植细胞获得性增殖优势促进了肝脏再殖

宿主肝细胞的代谢和增殖缺陷确实是移植细胞再殖受体肝脏的重要机制之一，但是临床上许多肝脏疾病中肝细胞的增殖能力和代谢水平并没有显著降低，如葡萄糖醛酸转移酶缺乏症、家族性高胆固醇血症、凝血因子VII缺乏症等。因此，通过对供体肝细胞基因的编辑，使细胞拥有比宿主细胞更强的生长或生存优势，从而实现肝脏的再殖。P27是一种细胞周期依赖性蛋白激酶抑制性因子，通过与cyclin A和cyclin E/Cdk复合体作用来抑制细胞进入增殖周期。p27Kip1敲除的肝细胞具有明显的增殖优势，因此该供体细胞移植入四氯化碳损伤的受体肝脏后，其再殖肝脏的效率可以达到12%～15%[27]。Foxm1B是调控细胞周期G1/S和G2/M转换的关键性因子，Foxm1B修饰的肝细胞变成了一种“超级肝细胞”，具备很强的增殖能力，进行移植后可以明显提高肝脏的再殖效率[28]。该研究还发现Foxm1B修饰的肝细胞具有一定的安全性，将移植的肝细胞分离培养连续增殖8个月或在小鼠皮下成瘤实验12周后均未发现癌变现象。Yes相关蛋白(yes-associated protein，YAP)是Hippo信号通路中最主要的效应因子，该通路主要调控细胞的增殖和器官的大小。当YAP蛋白入核与TEAD转录因子结合，就能够诱导下游促增殖、抗凋亡的基因表达。将携带Yap基因的慢病毒感染供体细胞并进行细胞移植，即使在没有任何受体肝脏损伤或增殖刺激的情况下，移植细胞再殖受体肝脏的效率也可以达到(8.9±2.6)%[29]。此外，通过调控供体细胞的倍体数也能够促进肝脏的再殖效率。转录因子E2F家族是调控细胞周期进程的重要蛋白，E2F7和E2F8的表达升高会促进肝细胞的多倍化，而抑制其表达则会促进肝细胞成功分裂成二倍体细胞。将外源性的多倍体肝细胞和二倍体肝细胞混合移植进受损的受体肝脏后，二倍体肝细胞不仅表现出了更强的再殖能力还抑制了多倍体肝细胞的增殖[30]。尽管赋予供体肝细胞生长以及生存优势是一种极具发展潜力的再殖策略，但是对于任何涉及基因组整合和增强细胞增殖能力的疗法，癌症形成风险的增加是制约其临床应用的一个重要因素。

2 非选择性优势下肝脏实现再殖的机制

在家族性高胆固醇血症、凝血因子VII缺乏症这类临床疾病中，肝细胞本身没有受到损伤并可以发挥一定的生理功能，因此在这种条件下移植细胞就很难完成有效的肝脏再殖。非选择性优势正是这类情况，它表现为宿主肝细胞最基本的肝功能是正常的，在此基础上宿主肝细胞和供体肝细胞对于外源性的增殖刺激会做出相同的反应。所以在非选择性优势情况下，即便是给予部分肝切或CCl4的增殖刺激，正常肝细胞的再殖效率也不会超过1%～2%。在正常分化成熟细胞无法表现出增殖，生存以及功能上的选择性优势的情况下，具备增殖能力强、多分化潜能和重构组织的能力的干/祖细胞是目前主要的研究方向。而到目前为止，只有大鼠的胎肝干/祖细胞植入接近正常肝脏才能够实现有效再殖[2，31-32]。研究显示仅仅只是在2/3肝切的增殖刺激下，ED14胎肝细胞在非选择性优势下的再殖效率就可以到达23%。但并非所有的胎肝细胞在非选择性优势的情况下都能完成有效的再殖，研究表明ED14胎肝前体细胞的再殖效率很高，但ED16胎肝前体细胞的再殖效率则很低[2]。因此，ED14胎肝细胞通常作为非选择性优势下肝细胞移植研究的主要细胞来源。而最近的研究发现，作为妊娠晚期分化程度更高的ED19胎肝细胞，它在部分肝切的增殖刺激下再殖效率却可以达到35%[31]。相比大鼠，小鼠的胎肝细胞在非选择性优势下的再殖率则小于1%[32]。目前，对于胚胎发育不同时期和不同种属之间胎肝细胞再殖效率差异的内在机制目前还尚不明确，而该机制的阐明对于促进非选择优势下的肝脏再殖有着重要意义。

3 肝脏微环境可促进移植细胞的再殖

我们发现，尽管在基于选择性优势和非选择性优势的情况下，移植细胞在受体肝脏中都可以取得较高的再殖效率，但这二者主要聚焦在宿主肝细胞和移植细胞本身的特性上。而最近的研究发现，肝脏微环境也是移植细胞完成肝脏再殖的重要潜在机制，通过调控宿主肝脏的微环境将可能成为今后临床上终末期肝病细胞治疗的新策略。诱导肝脏损伤为外源性细胞提供增殖刺激作为肝细胞移植中最普遍使用的手段，它引起的肝脏微环境改变对于细胞再殖起到了关键作用。例如，比较70%肝切除术后第1、2天和第3天可以发现，术后前2天，肝脏微环境主要以炎症细胞浸润和微循环紊乱为特征；而术后第3天，肝脏微环境中的生长因子表达上调和血管扩张有利于移植肝细胞的再殖[33]。这与肝切后HGF和FGF的高表达以及肝星状细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)密切相关[5，33]。有研究表明，单纯的70%肝切后，肝脏中趋化因子CXC水平仅仅增加了3到5倍，不足以促进外源性细胞的有效再殖。而通过注射外源性的趋化因子CXC后，肝细胞的再殖效率得到了明显提升[34]。此外，Fah基因缺失引起的肝细胞损伤上调了IGF2的表达，并通过激活PI3K/AKT和MAPK信号通路促进了供体肝细胞的再殖[4]。

除此之外，细胞衰老引起的肝脏微环境改变对细胞再殖也起到了重要作用。对经过倒千里光碱和肝切除处理后的年轻和老年受体进行肝细胞移植，结果发现供体肝细胞在年轻受体肝脏中的再殖效率明显高于老年受体。这个现象暗示了年轻肝脏微环境中存在某些促进再殖或是衰老肝脏微环境中存在抑制再殖的因素。通过对肝脏微环境中细胞因子表达水平进行分析发现，老年受体微环境中生长激素表达水平很低，而提高老年受体中生长激素水平后，再殖效率可以明显提高[35]。另一方面，将胎肝细胞同时移植到年轻和老年受体中可以发现，胎肝细胞在老年受体的再殖效率是年轻受体的4到5倍，这是由于在相比年轻受体，老年受体中Activin A的分泌增多，抑制了内源性肝细胞的增殖，而胎肝细胞能够抵抗Actvin A所诱导的效应，产生了明显的选择性优势[24]。细胞发生衰老后，不仅自身增殖能力受抑制，同时还会诱导基因表达异常，促进衰老相关分泌表型(senescence-associate secreted protein，SASP)。SASP会通过旁分泌的形式调控其微环境的其他细胞甚至是新植入受体肝脏的外源移植细胞，从而改变细胞的生物学特性。例如Serra等[3]发现宿主衰老肝细胞不仅为移植细胞的再殖提供了选择性优势，而且衰老细胞分泌的IL-6很可能促进了移植细胞的增殖。研究还发现，在衰老的肝脏微环境中，跨膜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及MMP的高表达会导致纤维粘连蛋白在内的细胞外基质的降解，有利于移植细胞的植入，而当移植细胞在受体肝脏中再殖时，蛋白酶的表达降低而细胞外基质被重塑，对移植细胞与受体肝细胞的整合起到了关键作用[26]。考虑到辐射治疗在临床上的广泛应用以及诱导衰老对于肝细胞和肝脏微环境的双重作用，辐射结合肝切诱导衰老是目前最新最具临床应用潜力的再殖策略。

细胞有效植入受体肝实质是实现肝脏再殖的关键一步，而通常供体细胞移植1～2 d内就会由于炎症反应而导致80%～90%的细胞从肝血窦中被快速清除。细胞的植入改变了肝脏基因的表达和血管张力，产生炎症反应，促进细胞黏附、血栓形成以及组织的损伤与重塑。而造成微环境巨大改变的根本原因是细胞移植后肝脏的缺血、内皮的损伤以及肝星状细胞，kupffer细胞，中性粒细胞的活化，因此，通过对这些现象进行人为干预或调控而提高移植细胞在受体肝脏的植入效率同样是移植细胞成功再殖受体肝脏的关键。研究显示使用内皮素受体拮抗剂体外孵育供体细胞后再进行移植，供体肝细胞能够抵抗肝脏中细胞因子产生的毒性，从而促进再殖[36]。细胞移植后也会导致宿主肝脏发生缺血，血管收缩因子如内皮素-1的招募，从而清除移植细胞。研究显示在肝细胞培养基中加入特异性的内皮素-1A受体拮抗剂可使得细胞移植后肝窦血管扩张，并且使得内皮细胞中炎症反应、细胞损伤、血管张力等相关基因的表达降低，从而促进移植细胞植入受体肝脏并提高了肝脏的再殖。同样在受体小鼠中注射内皮素-1A受体拮抗剂也可以提高肝脏的再殖效率[37]。相类似的，当受体小鼠注射肿瘤坏死因α(tumor necrosis factorα，TNFα)拮抗剂后，可以减少因外源细胞移植引起的细胞因子的分泌并可抑制中性粒细胞的活性，从而减少移植细胞的清除而促进肝脏再殖[38]。此外，研究还发现沙利度胺具有抗炎症和促内皮损伤的效应，能够阻断移植引起的炎症反应，如拮抗TNFα以及白介素1，2，6受体，抑制中性粒细胞和kupffer细胞活性等，并加剧细胞移植引起的内皮损伤效应从而提高肝细胞的再殖效率[39]。最近的研究还发现，通过尾静脉注射α-1抗胰蛋白酶，能够抑制肝细胞植入时血液介导的炎症反应，从而阻断补体和凝血途径的激活，减少血栓形成并降低促炎因子的表达，显著改善移植后48 h内的细胞植入效率，从而促进了肝脏的再殖[40]。通过调控肝脏微环境来改善植入效率从而促进肝脏再殖，这种方式不直接作用于肝细胞，肝毒性相对较小，具有良好的临床应用前景。

4 展望

根据传统的细胞移植动物模型构建的策略，选择性优势是移植细胞有效再殖肝脏的关键。通过抑制宿主细胞的增殖或者人为修饰的方式使供体细胞获得增殖优势都可以促进移植细胞在损伤肝脏中的再殖。但是这些方式都必须借助特殊的损伤条件，并不能完全与临床上所面临的肝脏疾病相匹配。细胞衰老是老年肝脏普遍存在的现象，而老年肝脏疾病的发病率又远远高于年轻个体，因此如果能够准确理解细胞衰老促进移植细胞再殖肝脏的主要调控机制，那将对老年肝脏疾病的细胞治疗带来新的希望。近年来越来越多的研究表明微环境对细胞命运的抉择起着至关重要的地位。移植细胞能够成功进入到宿主肝脏并进行增殖从而实现损伤肝脏的再殖都取决于细胞所处的微环境并受其周围细胞所释放的信号的调控。尽管目前大量的研究报道显示通过调控微环境的信号通路可以促进移植细胞植入受体肝脏和促进移植细胞在受体肝脏中的增殖，但是面对种种终末期肝脏疾病，细胞移植治疗的方案仍然还需要进一步探索。