正交优化提取刺松藻多酚及抗氧化活性研究

(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316022)

刺松藻Codium fragile Hariot.属松藻科，松藻属，是一种高膳食纤维、且富含铁、锌等微量矿质元素的天然绿藻，也是我国东海的优势大型绿藻[1]。CIANCIA，etal[2]证明其富含α(1→4)-D-葡聚糖、β(1→4)-D-甘露聚糖等多糖，生物活性显著，但对多酚的研究仍处于探索阶段[3]。目前研究多采用溶剂回流提取法、浸提法、超声波或微波辅助提取法、酶解法提取多酚，微波辅助提取法耗时较短、成本低。

本文以浙江温州南麂的刺松藻为原料，采用微波辅助法提取刺松藻多酚，采用紫外和红外光谱法对其结构特征进行初步探索，并以抗坏血酸为对照，测定并比较其清除DPPH、羟自由基能力和抗脂质过氧化能力，对其抗氧化活性进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

微波超声组合合成/萃取仪(XH-300A、北京祥鹄科技发展有限公司)；电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(UV-1100、上海美谱达仪器有限公司)；红外光谱仪(TENSOR-27)；数显三用恒温水箱(HH-W420、江苏金坛市白塔新宝仪器厂)；粉碎机；磁力搅拌器。

1.2 试剂与药品

刺松藻(采自浙江温州南麂)；没食子酸(国药集团化学试剂有限公司，批号20120423)，福林酚试剂(国药集团化学试剂有限公司，批号20170314)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号20170413)，碳酸钠，DPPH，抗坏血酸，邻二氮菲，硫酸亚铁，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，过氧化氢，三氯乙酸，硫代巴比妥钠。福林酚试剂为生化试剂，其他试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 刺松藻多酚的含量测定

采用Folin-Denis 比色法[4]，测定刺松藻提取液中多酚的含量。精密称定没食子酸标准品0.050 g，溶解定容，配制成0.010 g·mL-1的乙醇溶液。依次移取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL 浓度为0.010 g·mL-1的没食子酸溶液在试管内，用蒸馏水定容至0.5 mL，然后加入2.5 mL 30%福林酚试剂，震摇6 min 后加入2 mL 12% Na2CO3溶液，30 ℃避光水浴1 h 后，测定760 nm 波长的吸光度，平行实验重复3 次[5]。以没食子酸的量X(mg)为横坐标，以吸光度Y 为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线，回归方程为Y=20.933 X-0.006 5，R2=0.999 4，没食子酸在0.005～0.025 mg 的范围内呈现良好的线性关系。

准确称取刺松藻粉末于锥形瓶中，在试验条件下微波辅助提取，4 000 r·min-1离心15 min 取上清液，准确吸取0.5 mL 样品，重复上述操作，测定各组的吸光度，平行实验重复3 次。由标准曲线计算含量，刺松藻多酚含量=CNV/M×100%，式中：C 为提取液中多酚质量浓度(mg·mL-1)，N 为样品稀释倍数，V 为提取液体积(mL)，W 为刺松藻称样量(g)[6]。

1.3.2 单因素考察

对乙醇浓度、液固比、微波提取时间、微波功率4 个主要因素分别进行单因素试验[7]。考察乙醇浓度对刺松藻多酚含量的影响，精密称取刺松藻粉末1 g 加到250 mL 锥形瓶中，微波辐射功率为400 W，在液固比为25 的条件下，分别以0%、5%、10%、15%、20%的乙醇作为溶剂，微波处理45 s；考察微波功率、时间对多酚含量的影响，液固比均为25，去离子水作为萃取剂，前者以200 W、300 W、400 W、500 W、600 W 的微波功率处理45 s，后者控制微波功率为400 W，分别用微波处理25 s、35 s、45 s、55 s、65 s；考察料液比对多酚含量的影响，微波功率为400 W，时间为55 s，去离子水作为萃取剂，分别按照液固比15、25、50、75、100 加入，各组平行试验重复3 次。

1.3.3 正交试验设计

以单因素试验结果为基础，采用L9(34)正交实验法，优化微波辅助提取刺松藻多酚的工艺条件，以最优条件提取多酚，计算得率。选取液固比、微波时间、微波功率3 个因素为自变量进行正交实验，如表1 所示。

表1 刺松藻多酚提取工艺因素水平Tab.1 Factors for extraction of polyphenols from C.fragile

1.3.4 光谱分析

1.3.4.1 刺松藻多酚的紫外光谱分析

配置一定质量浓度的刺松藻多酚溶液，在200～500 nm 波长范围内利用酶标仪进行紫外-可见光波长扫描，得到刺松藻多酚的紫外光谱图。

1.3.4.2 刺松藻多酚的红外光谱分析

1.3.5 多酚抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力的测定

采用MONICA，et al[9]的方法测定。加入试液顺序与含量如下：1 mL 样品溶液(浓度分别为1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)+1 mL 无水乙醇+0.25 mL 0.02%的DPPH99.5%乙醇溶液；对照组用纯水替换样品；空白组用无水乙醇替换DPPH 溶液。将反应体系避光室温静置1 h，然后在517 nm 处测定各组的吸光度A。以与样品相同浓度的抗坏血酸为阳性对照，自由基清除率可用公式计算：DPPH 自由基清除率/%=(对照-样品+空白)/对照×100[10]。平行试验重复3 次。

1.3.5.2 清除羟自由基能力的测定

采用Fenton 反应测定[11]。加入试液顺序与含量如下：1 mL 0.75 mmol·L-1邻二氮菲+2 mL PBS (pH=7.40)+1 mL H2O+1 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4+1 mL 样品溶液(浓度分别为1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)，37 ℃恒温水浴1.5 h，在536 nm 处测得吸光度AX0；用0.12% H2O2替代样品，测得吸光度AX；用1 mL H2O 替代H2O2，测得吸光度A0。以与样品相同浓度的抗坏血酸为阳性对照，羟自由基清除率可用公式计算：羟自由基清除率/%=(AX-AX0)/(A0-AX0)×100。平行试验重复3 次。

1.3.5.3 抗脂质过氧化能力测定

采用Fe2+诱导法测定[12]。加入试液顺序与含量如下：0.4 mL 卵黄悬液+0.1 mL 样品溶液(浓度分别为1.25、2.5、5、10、20 μg·mL-1)+0.4 mL 25 mmol·L-1FeSO4+1 mL PBS(pH=7.45)+37 ℃恒温振荡15 min+1 mL 20%TCA+1 mL 0.8% TBA+沸水浴15 min，冷却后以4 000 r·min-1冷冻离心15 min，取上清液，在532 nm 波长处测定吸光度Am；对照组用0.1 mL PBS 缓冲液替换样品，测得吸光度Ab。卵黄悬液配置方法如下：取新鲜鸡蛋卵黄，用等体积0.1 mol·L-1PBS (pH=7.45)配制成悬液，磁力搅拌10 min，再用PBS 稀释成1:25 的卵黄悬液，冷藏备用。以与样品相同浓度的抗坏血酸为阳性对照，Fe2+诱导卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率可用公式计算：抑制率/%=(Ab-Am)/Ab×100。

1.4 数据分析

利用Excel 2016 进行实验数据的整理，利用SPSS 20.0 软件进行统计分析，并对正交试验结过进行方差分析(ANOVA)。

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2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对刺松藻多酚含量的影响

如图1 所示，当乙醇浓度增加时，刺松藻中提取所得的多酚的含量逐渐减少，当用去离子水提取时，提取率最大。由极性大小：水＞乙醇，从物质相似相溶原理的角度推测，刺松藻多酚提取物的极性与去离子水的极性相近，故使用去离子水提取多酚时，所得产率最大。故后续实验选用去离子水提取刺松藻多酚。

2.1.2 微波功率对刺松藻多酚含量的影响

如图2 所示，当微波功率增大时，多酚含量先增加后减少，当微波功率达到400 W 时，提取率最大。从动力学角度推测分析[13]，当微波功率增大时，溶液获得能量也增加，多酚提取液中产生小泡，小泡经产生、膨胀、破裂等过程[14]，使多酚从刺松藻中分离出来。当功率达到一定程度时，过高的功率可能导致结构破坏，提取率下降。

2.1.3 微波提取时间对刺松藻多酚含量的影响

如图3 所示，当微波时间增加时，多酚含量先缓慢增加后减少，当微波时间为55 s 时，提取率最大。从热力学角度推测分析，随着微波时间的增加，提取液温度逐渐上升，温度升高，溶液中的分子扩散速度加快，有利于多酚从刺松藻中分离进入溶剂。当微波时间为65 s 时，多酚含量减少，可能是多酚结构遭到了破坏[15]。

2.1.4 液固比对刺松藻多酚含量的影响

如图4 所示，当液固比增大时，多酚含量先快速增加后减少，当液固比为25 时，提取率最大。其原因可能是刺松藻中的多酚在液固比为25 时，已经能够大部分溶解在溶剂中，随着液固比的继续增加，多酚的含量反被溶剂稀释而减少,甚至会有其他杂质析出[16]。

图1 乙醇浓度对多酚含量的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on polyphenols content

图2 微波功率对多酚含量的影响Fig.2 Effects of microwave power on polyphenols content

图3 微波提取时间对多酚含量的影响Fig.3 Effects of irradiation time on polyphenols content

图4 液固比对多酚含量的影响Fig.4 Effects of liquid-solid ratio on polyphenols content

2.2 正交试验优化结果

利用SPSS20.0 软件对正交试验结果进行极差分析和方差分析，结果如表2 和表3 所示。

本实验通过正交试验优化了微波辅助提取刺松藻多酚的工艺条件，由表2 的极差分析结果可知，各因素对刺松藻多酚提取率影响大小顺序为C＞A＞B，即微波功率＞液固比＞微波时间，最优组合为A2B2C3，得出了最佳条件：液固比为25，微波辐射时间为55 s，微波辐射功率500 W[17]。由表3 可知，A、C 两个因素P值＜0.05，说明液固比、微波功率对刺松藻中多酚的提取率有显著性影响[18]，B 因素P 值=0.238＞0.05，其对多酚的提取率影响较小。

以最优条件提取刺松藻多酚，平行试验重复3 次，所得多酚含量为2.76 mg·g-1，提取率为0.28%。

表2 刺松藻多酚提取工艺正交实验结果与极差分析Tab.2 Results oforthogonal teston polyphenols content

表3 刺松藻多酚提取工艺方差分析表Tab.3 Analysis of variance on polyphenols content

2.3 光谱分析

2.3.1 刺松藻多酚紫外-可见光谱分析

由图5 可知，刺松藻多酚提取液的紫外-可见光谱图在220～280 nm 有较大吸光度，其可能为黄烷醇类、黄烷酮类等物质的特征吸收峰[19]。在220～280 nm 波长范围内的吸收峰强度明显大于在300～500nm 波长范围内的吸收峰强度，可猜测刺松藻提取液中黄烷醇类、黄烷酮类等物质含量较多。

2.3.2 刺松藻多酚红外光谱分析

由图6 可知，在500～4 000 cm-1范围内进行的IR 扫描[20]，图谱具有刺松藻多酚的特征吸收峰。3 250～3 400 cm-1强而宽的峰表明有O-H 伸缩振动νO-H，表明多酚结构中有羟基存在，且可能在提取过程中形成氢键，属于缔合O-H；2 926 cm-1弱峰可能是多酚C-H 伸缩振动νC-H；2 362 cm-1、2 334 cm-12 个中强而尖的峰猜测其结构中可能含有共轭的碳碳三键；1 648 cm-1可能为结合水的吸收峰；1 424 cm-1中强峰表明有C-H 面内弯曲振动δas (CH3)；1 101 cm-1强而宽的峰表明有酚类物质C-O 伸缩振动νC-O；759 cm-1弱峰可能由不饱和C-H 面外弯曲振动γ=C-H产生[21]。

图5 刺松藻多酚紫外-可见光谱图Fig.5 Ultraviolet-Visible Spectrum of Polyphenols from C.fragile

图6 刺松藻多酚红外光谱图Fig.6 Infrared Spectrum of Polyphenols from C.fragile

2.4 刺松藻多酚体外抗氧化活性研究结果

2.4.1 DPPH 自由基清除效果

如图7 所示，当刺松藻多酚浓度增大时，DPPH 自由基清除能力随之增强，但略低于同等浓度抗坏血酸的清除率。IC50(刺松藻多酚DPPH 自由基半抑制质量浓度)为20.12 μg·mL-1，其值越小，清除DPPH 自由基能力越强[22-23]。刺松藻多酚对DPPH 自由基具有一定的清除能力。

2.4.2 羟自由基清除效果

羟自由基作为活性最强的氧自由基，其半衰期极短[24]，最常见的产生自由基的反应是Fenton 反应，吸光度与羟自由基生成量呈正比。如图8 所示当刺松藻多酚浓度增大时，羟自由基清除能力随之增强，低浓度时与同等浓度抗坏血酸的清除率相当，随着浓度进一步增大，略低于同等浓度抗坏血酸的清除率。IC50(刺松藻多酚羟自由基半抑制质量浓度)为12.56 μg·mL-1，刺松藻多酚对羟自由基具有一定的清除能力。

2.4.3 抗脂质过氧化能力测定结果

如图9 所示，当刺松藻多酚浓度增大时，刺松藻多酚对Fe2+诱导卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用增强，但低于同等浓度抗坏血酸抑制率。当刺松藻多酚浓度为10 μg·mL-1时，抑制率为6.74%。刺松藻提取液抗脂质过氧化能力的测定过程中，可能由于Fe2+不稳定、反应干扰因素多、副反应等因素造成影响，原因仍需深入研究[25]。

图7 刺松藻多酚和维生素C 对DPPH自由基清除效果Fig.7 The scavenging effects of DPPH radicals by polyphenols and Vc

图8 刺松藻多酚和维生素C 对羟自由基清除效果Fig.8 The scavenging effects of hydroxyl radicals bypolyphenols and Vc

图9 刺松藻多酚和维生素C 对Fe2+诱导卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用Fig.9 The inhibitory effects of polyphenolsand VC on lipid peroxidation of vitellin induced by Fe2+

3 结论

本实验通过单因素试验确定了正交试验的主要条件，采用L9(34)正交实验法，优化了微波辅助提取刺松藻多酚的工艺条件，得出了最佳条件：液固比为25，微波辐射时间为55 s，微波辐射功率500 W，多酚含量为2.76 mg·g-1，提取率为0.28%。由极差结果分析得出，各因素对刺松藻多酚提取率影响大小顺序为微波功率＞液固比＞微波时间，由方差分析结果得出，液固比、微波功率对刺松藻中多酚的提取率有显著性影响。

由紫外-可见光谱图分析结果可知，在220～280 nm 刺松藻多酚提取液有较大吸光度，其可能为黄烷醇类、黄烷酮类等物质的特征吸收峰。由红外光谱分析结果可知，刺松藻多酚结构中可能含有νO-H、νC-H、νC-O、γ=C-H等振动，推测其含有酚羟基。

刺松藻多酚DPPH 自由基半抑制质量浓度IC50为20.12 μg·mL-1；羟自由基半抑制质量浓度IC50为12.56 μg·mL-1；浓度为10 μg·mL-1时，对Fe2+诱导卵黄脂蛋白脂质过氧化抑制率为6.74%，具有一定的抗脂质过氧化能力。综合考虑，刺松藻多酚具有一定的抗氧化活性。

综上所述，本实验利用正交试验优化了刺松藻多酚的提取工艺，与传统多酚提取法相比，微波辅助提取法省时、高效、节能，降低提取成本。同时对多酚结构进行了简单探索，还对刺松藻多酚进行了抗氧化研究，各项指标表明刺松藻具有一定的抗氧化能力，其中清除DPPH 自由基的能力和清除羟自由基能力较强，为刺松藻的开发和利用奠定了一定的基础。