养殖松江鲈鳗弧菌的分离鉴定及药敏试验

夏苏东，尤宏争，李 楠，郝 爽，尹 川，张 丹，张振国，吕 爽，仲 雷

(1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.天津市水产研究所，天津 300221)

松江鲈Trachidermus fasciatus Heckel，隶属于鲈形目，杜父鱼科，松江鲈鱼属，又名四鳃鲈、花鼓鱼、媳妇鱼等，主要分布于中国、菲律宾、日本以及朝鲜半岛，中国境内主要分布于沿海河口地区，北起鸭绿江，南至福建九江[1]。松江鲈鱼味道鲜美，有着“江南第一名鱼”之美称，而且医用价值极高，《本草纲目》中有“松江鲈鱼，补五脏，益筋骨，和肠胃，益肝肾，治水气，安胎补中，多食宜人”。但是，近几十年松江鲈鱼野生资源遭到严重破坏，已被列为中国优先保护鱼类一级动物名录，国家二级保护动物[1]。目前，如何保护松江鲈鱼，尽快恢复松江鲈鱼资源，已成为水产科技人员研究的重要课题。

国内外主要开展了对松江鲈人工繁育、胚胎发育、养殖模式、种群分布和资源状况、洄游特征、自残行为等进行了研究，但是对于疾病的研究较少[2-3]。2014 年，松江鲈鱼首次在天津繁育成功，养殖期间部分松江鲈开始发病，主要症状为头顶部严重溃烂、可见头骨，鱼体较正常鱼发白，鳃盖、鳍条出血等，行动迟缓，停止进食，最后死亡。剖检可见腹腔内有积水，肝脏、脾脏有出血点。从发病的松江鲈肝脏处分离到一株优势菌，命名为SJL-1，将SJL-1 人工注射到健康松江鲈体内，可导致健康松江鲈患病，证实该菌株致病性较强，通过对SJL-1 菌落的基本形态特征、主要的生理生化特性以及16S rDNA 基因分析并构建系统发育树，表明该病原菌为鳗弧菌Vibrio anguillarum，最后进一步对SJL-1 进行了药物敏感性试验，为防治松江鲈鱼溃疡病提供了参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

发病松江鲈取自天津某养殖场，体长为8.55±1.36 cm，体质量为20.42±1.73 g，发病时水温21 ℃。人工感染实验所用健康松江鲈采自同一养殖场未患病养殖池，规格大小同患病鱼，水温在21 ℃下暂养7 d 后开始实验。

1.1.2 主要仪器和试剂

全自动细菌鉴定仪(VITEK 2 compact)购自法国梅里埃公司；普通营养琼脂购自北京陆桥公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司；扩增细菌16S rDNA 所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，2×PCRmix 购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与培养

病原分离在无菌条件下进行，用75%酒精棉对鱼体表消毒，分别从肝脏、肾脏和头部溃疡处分离病原，接种于普通营养琼脂平板上，28 ℃条件下倒置培养24～48 h。根据菌落形态、大小、边缘光滑程度等确定优势菌，选取优势菌进一步纯化，28 ℃下继续培养24 h，得到菌落单一的优势菌。

1.2.2 生化鉴定

对优势菌进行革兰氏染色，确定优势菌是革兰氏阳性还是阴性菌，以便选择不同的菌卡，将培养24 h以内的新鲜菌落接到0.85%的生理盐水，细菌浓度调到0.5～0.63 个麦氏比浊度，在全自动细菌鉴定仪上进行鉴定。

1.2.3 16S rDNA 基因分子鉴定

采用离心柱抽提法提取菌株SJL-1 的基因组，合成细菌16S rDNA 通用引物，正向引物F 序列为：(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)，反向引物R 序列为：(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′)，以提取SJL-1 的DNA 为模板，反应体系为50 μL：在0.2 mL 反应管中加入2×PCRmix 25μL、浓度为10 nmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL、22 μL 灭菌水、模板2 μL。PCR 反应步骤为：95 ℃预变性3 min；95 ℃，30 s、55 ℃，30 s、72 ℃，1 min，进行35 个循环；72 ℃保温5 min。PCR 产物送上海生工进行测序，将序列在美国国立生物信息技术中心网站上进行比对分析，选取部分同源性较高的序列，使用MEGA4.0 软件N-J 邻接法构建系统进化树。

1.2.4 药物敏感性试验

药物敏感性试验采用K-B 纸片法进行[4]，用血球计数板将SJL-1 浓度调至1×108cfu·mL-1，用涂布棒将200 μL 菌液均匀地涂于LB 培养基平板表面，然后将药敏纸片贴于培养基上，28 ℃条件下倒置培养24 h，对药敏片周围形成的抑菌圈进行测量。依美国临床实验室标准化协会(CLSI)药敏试验判断标准判断菌株SJL-1 对18 种药物的敏感程度。

1.2.5 人工感染试验

将SJL-1 接种于LB 液体培养基，28 ℃条件下150 r·min-1振荡培养24 h，离心后用生理盐水调节菌落浓度到3×108cfu·mL-1。60 尾健康松江鲈随机分为2 实验组，感染组和对照组，每组3 个平行，每个平行10 尾鱼，采用腹腔注射，剂量为0.1 mL/尾，对照组注射同等剂量的生理盐水。每天观察试验鱼的发病情况并进行死亡统计，连续观察14 d，如有发病鱼则按照上述方法重新进行病原分离及鉴定。

2 结果

2.1 病鱼症状

发病松江鲈主要表现为头部严重溃烂、可见头骨(图1)，鳃盖、鳍条等充血严重(图2)，身体发白、腹部膨大、肝脏、脾脏点状充血，腹腔有积液。

图1 头部溃疡Fig.1 Headulce

图2 鳃盖充血Fig.2 Operculum hyperemia

2.2 菌落形态特征

取病鱼肝脏处划线分离到一株优势菌，命名为SJL-1，在营养琼脂培养基上该菌菌落呈圆形，表面光滑、中央隆起、不透明、淡黄色菌落，直径约0.8 mm，革兰氏染色呈阴性。

2.3 生化结果

采用全自动生化鉴定仪对SJL-1 进行鉴定，选取革兰氏阴性鉴定卡，鉴定结果见表1。参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》以及饶颖竹等[5]对36 株不同来源的鳗弧菌生化反应结果分析，硫化氢、鸟氨酸脱羧酶、侧金盏花醇、N-乙酰-β-半乳糖氨酶、尿素酶、L-阿拉伯醇等指标100%为阴性，菌株SJL-1 与以上指标完全吻合，结合菌落形态初步鉴定该菌株属于弧菌科的鳗弧菌。

2.4 16S rDNA 分子鉴定结果

菌株SJL-1 的16S rDNA 基因测序结果显示长度为1445bp(图3)，将其序列在NCBI 进行Blast 比对分析，结果显示，菌株SJL-1 与鳗弧菌Vibrio anguillarum(登录号：X16895)相似度达到99%，采用邻接法构建菌株分子发育树(见图4)，SJL-1 与鳗弧菌聚为一支，结合其主要生理生化特性，确认鳗弧菌为患肝脏病松江鲈的病原菌。

表1 生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of SJL-1

图3 菌株SJL-1 16S rRNA 基因序列电泳图Fig.3 Amplification of 16S rRNAsequence of strain SJL-1

图4 SJL-1 16S rRNA 基因序列进化树Fig.4 Phylogenetic tree of strain SJL-1 based on 16S rRNA

2.5 药敏试验结果

结果显示，在18 种抗菌药物中，SJL-1 对庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、新生霉素5 种抗生素具有高度敏感性，对左氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、阿莫西林、强力霉素、氨苄西林7 种药物中度敏感；对青霉素、阿奇霉素、链霉素、甲氧嘧啶、奥格门丁、萘啶酸6 种药物不敏感(表2)。

2.6 人工感染试验结果

试验结果显示，注射组在第5 d 开始个别鱼患病并出现鳃盖充血等典型症状，14 d 内死亡率高达70%，对照组没有死亡病例。从具有典型症状的患病松江鲈体内重新分离到了鳗弧菌，证实鳗弧菌是引起这次松江鲈溃疡病的主要病原菌。

表2 SJL-1 药物敏感试验Tab.2 Drug sensitivity test of SJL-1

3 讨论

目前，有关松江鲈疾病研究报道较少，主要是水霉病、白皮病、细菌性烂鳃、车轮虫病等。张飞明等[6]报道松江鲈白皮病的主要症状是鱼体头顶部和背部表皮受伤明显，严重时露出骨骼；他分析病因为鱼头部、背部受创伤后，细菌感染所致，但没有进行病原菌的分离鉴定等研究。潘连德[7]报道松江鲈白皮病主要原因是临产和产后的亲鱼被鱼巢刮伤皮肤，进而感染细菌,临床症状为头部及体表发炎、肿胀、严重的表现溃疡,患病鱼体表发白。随着病情逐渐恶化,病鱼出现单独游动,反应较健康鱼迟钝，停止摄食，作者分析病因为鱼体创伤后感染一种气单胞菌。

鳗弧菌引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染斜带石斑鱼Epinephelus coioides[5]、丁鱥Tinca tinca[8]、香鱼Plecoglossus altivelis[9]、鲈鱼Lateolabrax japonicus[10]、鳕鱼Gadus morhua[11]、大菱鲆Scophthalmus maximus[12-13]、牙鲆Paralichthys olivaceus[14]、大黄鱼Larimichthys crocea[15]等。鳗弧菌是一种条件致病菌，在一些养殖条件不利的情况下便会诱发鱼类患病，如养殖水体水质不良、鱼体受到刺激或者受伤等。鳗弧菌有多种感染途径，通过皮肤、鳃以及肠道组织侵入等。感染鳗弧菌的鱼会出现全身性的组织病变。不同的鱼感染鳗弧菌后会表现不同的症状，但主要症状是体表、鳃盖出血，鳍部、肝脏、有黄色粘稠腹水等。感染鳗弧菌的养殖牙鲆最明显的症状是鳍条、鳍基部以及鳃骨充血发红,肛门红肿，肌肉组织点状出血，体表发黑,鳍部溃烂[14]。感染了鳗弧菌的大菱鲆，主要症状为鳃盖、体表有出血点，腹腔膨胀有积液，脾脏、肝脏出血，肠道内有淡黄色黏液[15]。本文中发病松江鲈的症状与牙鲆、大菱鲆感染鳗弧菌后相似。

郭杨柳等[12]报道从患病大菱鲆分离到的鳗弧菌对氟苯尼考、头孢唑啉、庆大霉素等药物高敏；饶颖竹等[5]从患病斜带石斑鱼分离到的鳗弧菌对庆大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、诺氟沙星和左氟沙星等7 种抗菌药物高度敏感；张昕等[16]用8 种常用抗生素对4 种常见致病性弧菌进行药物敏感性试验，其中鳗弧菌对庆大霉素、氯霉素具有敏感性。本试验挑选了18 种抗菌药物，对SJL-1 进行药物敏感性试验，鳗弧菌对庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、新生霉素5 种抗生素具有高度敏感性，综合以上研究结果，鳗弧菌主要对庆大霉素、新生霉素、氟苯尼考等药物敏感，为治疗松江鲈鳗弧菌病提供用药指导。