骨髓单核细胞和RAW264.7细胞诱导培养破骨细胞的条件研究

★ 杨佛 杨文龙 李明慧 李威 刘璞 杨凤云*（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

1 破骨细胞培养方法概述

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是影响中老年人生活的重大健康问题，它的发生与成骨细胞（osteoblast，OB）和破骨细胞（osteoclast，OC）的关系失衡密切相关，OB功能下降而OC功能亢进是其发生的主要机制［1］，近年来越来越多研究表明OC功能亢进与OP的发病更为密切［2］。OC是一种终末分化细胞，不能传代培养［3-4］，对于它的培养一直是个难题，由此极大地限制了骨科领域的研究进展。一种理想良好的OC培养方法对OC的研究意义重大。

OC的培养方法有机械分离法和诱导法，诱导法包括骨髓单核细胞诱导法、RAW264.7细胞诱导法、脾干细胞诱导法、外周血单核细胞诱导法、骨髓单核细胞和成骨细胞共育诱导培养法等［5-8］。国外学者chamber等［9］首次用机械分离法培养出了成熟OC，国内最早由史凤芹等［10］运用该方法从新西兰大白兔长骨骨髓腔内提取细胞并培养出了OC。但该方法培养时间长，得到的OC纯度低［11］，随着生物技术的进步已经逐步被其他改良的方法所取代。诱导剂的出现使OC的培养方法得到了极大的改善［12］，李雨民等［13］用大鼠骨髓单核细胞加1α 25-（OH）2 Vit D3成功诱导出了OC，曾立等［14］用C57BL/6小鼠骨髓单核细胞加巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB Ligand, RANKL）诱导因子成功诱导出了成熟OC，董强等［15］则用SD大鼠骨髓单核细胞加维生素D3和地塞米松成功诱导出了成熟OC。RAW264.7细胞株的出现打破了OC不能传代的缺点，使OC培养方法得到了巨大的发展。戴闽等［16］用RAW264.7细胞加RANKL成功诱导出了OC，李新等［17］用RAW264.7细胞加M-CSF、RANKL、1α 25-（OH）2 Vit D3成功诱导出了成熟OC。

当前大多数研究者都采用骨髓单核细胞和RAW264.7细胞诱导培养OC，但很多人都未成功。我们在培养OC时也运用这两种方法进行培养，一开始也遇到诸多问题导致诱导未成功，通过不断改进实验方案才成功。我们发现在OC培养过程中有诸多实验细节需要注意，因此本文就OC培养过程中的细节和步骤进行论述，希望为研究OC的骨科同道提供指导和帮助。

2 材料与方法

2.1 材料 高糖DMEM培养基、红细胞裂解液（北京索莱宝公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（上海依科赛公司）；M-CSF、RANKL（美国peprotech公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（贝博公司）；倒置显微镜（OLYMPUS CKX41）；倒置荧光显微镜（OLYMPUS IX71）。SPF级SD大鼠购自江西中医药大学实验动物中心；RAW264.7细胞购自中科院上海细胞库。

2.2 方法

2.2.1 骨髓单核细胞诱导法 取3～4周龄SD大鼠4只，脱颈处死后放入酒精中浸泡5 min，分离双下肢和双上肢（保留上下关节），移入细胞超净工作台内，剔除双侧股骨、胫骨、肱骨软组织（软组织尽量剔干净），剪断双侧干骺端，将长骨浸泡在DMEM中，用无菌剪刀纵行剪开骨干，用刀片刮出骨髓腔中的细胞（刮至骨髓腔变白），用移液枪将刮出的细胞悬液吹打混匀，用细胞筛将得到的细胞悬液过滤，装入15 mL的离心管中以1 000 r/min转速离心5 min，离心后弃上清，加入2 mL红细胞裂解液进行裂解，用移液枪吹打混匀，放入冰中孵育7 min，7 min后以1 000 r/min转速离心3 min，弃上清，加入4 mL 10 %FBS重悬，将细胞悬液吸入培养皿中，放入CO2培养箱（37 ℃，5 %CO2）中培养24 h，24 h后取上清液离心（1 000 r/min，3 min），离心后重悬，加入含M-CSF（50 ng/mL）的10 %FBS培养，放入CO2培养箱中培养48 h，48 h后弃上清，用细胞刮将贴壁细胞刮下，1 000 r/min转速离心3 min，弃上清，用血小球计数板计数，按每孔2×105个细胞量将细胞接种至6孔板中，再加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10 %FBS诱导培养，每2 d半量换液，直到镜下观察见大量体积较大的多核细胞时行TRAP染色。

2.2.2 RAW264.7细胞诱导法 从-80 ℃冰箱或液氮罐中取出装有RAW264.7细胞的冻存管，在37 ℃水浴锅中迅速摇晃数次，待管中冰晶溶解后迅速将冻存管中细胞悬液抽入装有4 mLDMEM的管中，用移液枪吹打几次，以1 000 r/min转速离心3 min，弃上清，加入4 mL 10 %FBS培养液进行培养，每2 d换液一次，待细胞长至80 %～90 %时准备细胞刮进行传代。传代时先弃去旧培养液，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）清洗培养瓶2遍，加入4 mL高糖DMEM，用细胞刮沿一定方向将细胞轻柔刮下，刮细胞时应保证底部细胞有DMEM浸润，刮完后收集细胞悬液，以1 000 r/min转速离心3 min，弃上清，加入2 mL 10 %FBS重悬，用移液枪吹打混匀，再从中抽出10 μL细胞母液加入90 μL的DMEM中进行稀释，再从稀释后的100 μL细胞悬液中抽取10 μL滴入盖玻片内，用血小球计数板进行计数，计数完成后按每孔1×105个数量接种细胞至6孔板中培养，加入含M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）的10%FBS诱导培养，每2 d半量换液，直到镜下见大量体积较大的多核细胞时行TRAP染色。

2.2.3 TRAP染色及计数 骨髓单核细胞和RAW264.7细胞诱导培养5d后镜下见大量成熟OC时行TRAP染色，染色步骤按照试剂盒说明书进行，镜下随机选取4个视野，计数TRAP阳性且细胞核数量≥3的细胞。

2.2.4 统计学方法 数据分析采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示。

3 结果

3.1 倒置显微镜下细胞形态学特点

3.1.1 骨髓单核细胞诱导法 从SD大鼠骨髓腔中提取的细胞经红细胞裂解后呈小圆形，颜色透亮，放入培养箱培养24 h后可见较多细胞贴壁，加入M-CSF诱导后细胞体积增大，细胞伸出伪足，加入RANKL共同诱导后细胞伪足增多，分化明显，M-CSF和RANKL共同诱导4 d时可见体积较小的OC形成，OC颜色较暗，5 d时OC体积增大，6 d时OC体积最大，8 d时OC体积减小，开始出现凋亡（图1）。

图1 倒置显微镜下骨髓单核细胞诱导法培养OC的形态变化（200×）

3.1.2 RAW264.7诱导法 正常RAW264.7细胞呈圆形或类圆形、颜色透亮，加入M-CSF和RANKL诱导3 d后细胞呈团簇状生长且伸出伪足，诱导第4 d时镜下可见体积较小的多核OC形成，OC颜色较暗，第5 d时OC数量增多，OC细胞质内见大量细胞核，同时可见许多悬浮的RAW264.7细胞，第6 d时融合的OC继续增多（图2）。

图2 倒置显微镜下RAW264.7细胞培养OC的形态变化（400×）

3.2 TRAP染色

3.2.1 骨髓单核细胞诱导法诱导原代OC染色 TRAP染色镜下可见体积较大的成熟OC，细胞核深染，边界清楚，同时可见散在的体积较小的OC，细胞核可达数个到数十个（图3-4）。

图3 原代OC TRAP染色（40×）

图4 原代OC TRAP染色（100×）

3.2.2 RAW264.7细胞诱导OC染色 TRAP染色镜下观察见大量体积较大的OC，可见核呈深染，细胞核可达数十个（图5-6）。

图5 RAW264.7细胞诱导5d TRAP染色（40×）

图6 RAW264.7细胞诱导5d TRAP染色（100×）

3.2.3 骨髓单核细胞和RAW264.7细胞诱导OC TRAP阳性细胞数如下表所示，总体而言RAW264.7组TRAP阳性细胞数多于骨髓单核细胞组（见表1）。

表1 骨髓单核细胞和RAW264.7细胞TRAP阳性细胞数（±s，n=4）

表1 骨髓单核细胞和RAW264.7细胞TRAP阳性细胞数（±s，n=4）

分组 TRAP阳性细胞数（n=4）40× 100×骨髓单核细胞 6±2.2 3±1.2 RAW264.7细胞 15±1.5 4±1.8

4 讨论

笔者采用骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞诱导法均培养出了体积较大且TRAP染色阳性的成熟OC。但在整个培养过程中要注意几个技术要点，这几个关键点是决定能否成功培养出OC的关键。

4.1 细胞纯化 该问题主要与骨髓单核细胞诱导法培养OC有关。因为骨髓腔内细胞种类很多，有红细胞、淋巴细胞、单核细胞、脂肪细胞、骨髓间充质干细胞等［18］，单核细胞是诱导OC的关键细胞，但它在骨髓腔中数量极少，如果不进行纯化则很难形成OC［13］，笔者在刚开始培养OC时未注意到该要点导致OC诱导一直不成功，因此对于单核细胞的纯化尤为重要。具体操作细节是在刮出骨髓腔内的细胞后进行离心，离心之后肉眼可见一红色团块，然后加入红细胞裂解液将红细胞裂解，再利用骨髓间充质干细胞贴壁速度快的特点，将去除红细胞的细胞放入培养箱中培养24 h，24 h后骨髓间充质干细胞基本贴壁，此时取上清液进行离心即可得到单核细胞。离心后再加入含M-CSF（50 ng/mL）的10 %FBS诱导培养2 d，因M-CSF能特异性促进骨髓单核细胞增殖，因此2 d后贴壁的细胞大多是单核细胞，2 d后将单核细胞传代，按照一定的密度种植到培养瓶或6孔板中即可进行后续的分子生物学研究。而淋巴细胞为悬浮细胞，它存在于细胞上清中，所以可以通过换液将其去除，因此，通过该方法可以得到高纯度的单核细胞，再在该基础上加入两种诱导因子就能得到高纯度的OC。

4.2 传代方法 无论是骨髓单核细胞还是RAW264.7细胞的传代，细胞刮刀都是最为推荐使用的方法。因为这两种细胞都有贴壁性强的特点［19］，用0.25 %的胰酶难以将其消化下来。笔者曾用0.25 %胰酶消化液（含EDTA）消化10min都未将单核细胞消化下来，还因此导致了大量单核细胞的损失。而细胞刮刀可将大部分细胞刮下来，比胰酶消化法获得的细胞数量多，最大程度的避免了细胞的损失。在使用细胞刮传代时动作应轻柔，且在操作过程中瓶内要保证有DMEM浸润，防止在刮细胞过程中贴壁的细胞失水皱缩，进而影响细胞活力和功能。

4.3 诱导因子的浓度 在利用骨髓单核细胞诱导OC时需要两种诱导因子（M-CSF和RANKL）共同诱导，笔者注意到缺少M-CSF则骨髓单核细胞不再增殖。RAW264.7细胞是Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c生成肿瘤后，收集小鼠腹水中单核样巨噬细胞得到的细胞株，其实质是破骨前体细胞［20］。有文献表明其自身可分泌M-CSF，在用RAW264.7细胞诱导OC时可以不加M-CSF［21-22］。笔者在实验中对加与不加M-CSF两种条件都进行了探索，发现只加RANKL的组在OC的形成时间上与加M-CSF、RANKL两种因子的组接近，大约4 d左右形成OC，但加了两种诱导因子的组形成的OC数量多，且体积更大。因此笔者建议在用RAW264.7细胞诱导培养OC时加入M-CSF和RANKL双因子共同诱导。除了M-CSF浓度影响OC形成外，RANKL浓度也影响OC形成，影响甚至更大。笔者在实验中对RANKL两种浓度进行了探索，发现M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）组比M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（50 ng/mL）组诱导形成OC的概率高，M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（50 ng/mL）诱导形成OC所需时间长。因此推荐的浓度是M-CSF（50 ng/mL）、RANKL（100 ng/mL）。通过该浓度培养4d左右可见小的OC形成，5 d可见较大的OC，6 d最多。因此加入细胞因子后诱导培养5～6 d就要进行后续的实验，否则OC会较少甚至凋亡。

4.4 细胞的种植密度 细胞的种板密度对成功诱导OC同样重要。种植密度太高、太低都会导致OC形成较少，甚至无法形成OC［23］。其原因可能是种植密度太高，细胞所需要的细胞因子也较多，而如果细胞间的空隙较少，细胞则没有足够的空间和营养来达到形成OC的条件；种植密度太少则细胞生长缓慢，诱导形成的OC少。笔者通过实验比较发现用骨髓单核细胞诱导法在6孔板上每孔种植2×105个细胞量是较合适的细胞数量，而RAW264.7细胞6孔板上每孔种植1×105个细胞量比较适合，能形成较多OC。RAW264.7细胞在同一种植面积下种植细胞数量少于骨髓单核细胞，究其原因，可能在于RAW264.7增殖速度快，种板后诱导5 d左右就能形成OC，因此种植数量要小于骨髓单核细胞。

4.5 细胞状态 主要是指RAW264.7细胞，RAW264.7细胞生长增殖速度快，所需营养旺盛，因此一般1～2 d换液一次［24］，如果细胞因缺乏营养导致细胞活力较差时，则不能传代种板，如果此时传代则会产生大量细胞碎片，细胞存活率较低，影响诱导效果，甚至导致无OC形成，这样会导致细胞因子的浪费。因此种板前一定要仔细观察，待细胞状态好、颜色透亮时才能进行。具体诱导培养要点见表2。

表2 骨髓单核细胞和RAW264.7细胞诱导OC技术要点

5 总结与展望

骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞诱导法均能诱导形成体积较大，TRAP染色阳性的多核OC。这两种方法诱导形成OC的时间相近，都是4 d开始出现较小OC，5～6 d出现体积较大的OC。总体而言，加上细胞纯化的时间骨髓单核细胞诱导法培养OC的时间长于RAW264.7细胞诱导法，且骨髓单核细胞诱导法操作过程复杂，而形成的OC数量少于RAW264.7细胞诱导法，同时该方法需要大量的大鼠才能获得较充足的骨髓单核细胞，因此如果要进行后期的Western Blot和qPCR实验使用该方法成本较高。而RAW264.7细胞可以传代和冻存，增殖速度快，诱导形成的OC数量多，即使是进行后续的分子生物学研究也有足够的数量进行实验，长远来看成本要低于骨髓单核细胞诱导法。尽管如此，骨髓单核细胞诱导法同样具有其优点，该方法是直接从大鼠骨髓腔中提取细胞进而诱导培养形成OC的，该方法获得的OC与人体OC生存条件类似，通过该方法研究得出的结论更具说服力，可信度高，意义更大。

自1982年chamber应用机械分离法首次培养出OC到现在已过去30余年，OC培养方法在此期间也得到了不断的改良和完善，特别是诱导剂的问世和细胞株的出现填补了OC相关领域大量的空白，使得OC研究领域得到了较大的发展。尽管如此，诱导剂价格高以及RANKL用量大的问题却限制着OC研究的发展，希望随着科技的发展和生化技术的进步这些问题能逐一解决。