黄地安消胶囊对GK大鼠胰岛素耐量及IRS-1蛋白表达的影响*

★ 郭明飞 高家荣 王建青 姜辉 方朝晖 魏良兵（.安徽医科大学第四附属医院 合肥 300；.安徽中医药大学第一附属医院 合肥 3003）

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）是以高血糖伴有胰岛细胞分泌不足而引起的内分泌紊乱性疾病［1-2］。持续的高血糖会诱发高血压、高血脂以及糖尿病血管病变等一系列并发症的发生。黄地安消胶囊由葛根、麦冬、黄连、生地等六味中药组成，前期药学及药理学研究已证实其具有改善GK大鼠FBG，HbA1c、FINS等作用［3］，且质量稳定［4］。但其对调节胰岛素耐量及骨骼肌IRS-1蛋白的调控作用尚不清楚。本实验选用自发性T2DM模型GK大鼠为实验对象，研究黄地安消胶囊对GK大鼠胰岛素耐量，胰腺细胞表达以及 IRS-1基因的调节作用，探讨其治疗糖尿病症状的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 动物 8～9周龄SPF级GK大鼠，雄性，体质量（220±10）g，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。8～9周龄SPF级Wistar大鼠，雄性，体质量（220±10）g，来源于安徽医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 药物 黄地安消胶囊为安徽中医药大学第一附属医院治疗糖尿病的院内制剂，按处方称取适量药材，加10倍量水加热提取1.5 h，倒出滤液后加8倍量水继续加热提取1 h，合并滤液，静止24 h后滤去残渣，滤液经浓缩干燥后制得干浸膏样品以备用。参芪降糖颗粒，鲁南厚普制药有限公司，批号00115257。

1.1.3 试剂 荧光定量PCR试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］；RIPA裂解液、DAPI 染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（均购自杭州碧云天生物技术研究所）；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；苏木素染液（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.4 仪器 GA-3型血糖仪（三诺生物传感股份有限公司）；D3024R台式高速冷冻型微量离心机（DragonLab公司）； RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JJ-12J全密封自动脱水机、JB-P5石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；正置荧光显微镜（Nikon Eclipse C1）；7500型荧光定量 PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 采用血糖仪测定GK大鼠尾静脉血糖值，选用随机血糖和糖负荷2 h血糖值均大于11.1 mmol/L的GK大鼠纳入实验［5-7］。随机分为模型组、参芪降糖颗粒组（1.08 g/kg）、黄地安消胶囊组（12，6，3 g/kg），每组10只，另取10只Wistar大鼠为对照组，每天1次，连续给药6周。

1.2.2 胰岛素耐量试验（ITT） 于给药后第6周进行胰岛素耐量试验，实验前禁食12 h，尾静脉测0min的血糖值，腹腔注射胰岛素（0.5U/kg），测定30、60、120 min的血糖值。

1.2.3 胰腺组织病理形态学的改变 取胰腺组织放置于10%的中性甲醛溶液中固定，待检测前取出胰腺组织，做常规石蜡包埋，并进行HE染色，观察胰腺组织病理损伤的程度。

1.2.4 RT-qPCR技术检测骨骼肌IRS-1 mRNA的表达 取大鼠骨骼肌组织，Trizol法提取组织总RNA，经逆转录酶反转录成cDNA，RT-qPCR技术检测骨骼肌IRS-1mRNA的表达，以β-actin为内参。各引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot技术检测骨骼肌IRS-1蛋白的表达 取大鼠骨骼肌组织，匀浆，加蛋白裂解液提取总蛋白，BCA蛋白浓度试剂盒进行定量。SDS-PAGE电泳分离，电转印至PVDF膜，TBST缓冲液封闭处理，加入一抗（1∶1000），4℃放置过夜，进行二抗（1∶5000）孵育，洗膜后经HRP-ECL发光法进行鉴定，通过凝胶成像系统分析定影后蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 对大鼠ITT的影响 与对照组比较，模型组GK大鼠血糖明显升高，有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，黄地安消胶囊组大鼠血糖在30、60、120min时间点均具有降低作用，且差异具有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 黄地安消胶囊对GK大鼠ITT的影响（±s，n=10） mmol/L

表2 黄地安消胶囊对GK大鼠ITT的影响（±s，n=10） mmol/L

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量g/kg 0min 30min 60min 120min对照组 - 4.68±0.65** 3.71±0.72** 3.19±0.21** 4.27±0.56**模型组 - 7.81±0.32 6.56±0. 71 5.65±1.05 6.38±0.50参芪降糖颗粒组 1.08 6.54±0.82** 5.76±0.71** 5.12±0.56 5.96±0.39黄地安消胶囊组 12 5.94±0.44** 4.95±0.67** 4.12±0.70** 5.11±0.67**黄地安消胶囊组 6 5.34±0.66** 3.95±0.49** 3.69±0.58** 4.64±0.69**黄地安消胶囊组 3 6.19±0.70** 5.24±0.63** 4.66±0.89** 5.48±0.70**

2.2 对大鼠胰腺组织形态学的影响 对照组大鼠胰岛组织结构完整，与周围界限清晰，细胞排列紧密，无明显异常。模型组大鼠胰岛细胞排列疏松，形态紊乱，与周围组织界限模糊，胰岛细胞数目较正常组降低。参芪降糖颗粒组胰岛组织与周围界限较清晰，细胞数目较模型组略有升高。黄地安消胶囊组胰岛细胞形态较稳定，排列基本规格，细胞数目较模型组具有不同程度的增加，细胞排列基本规则，结果见图1。

图1 黄地安消胶囊对大鼠胰腺组织形态学的影响（×200）

2.3 对大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA表达的影响 如图2所示，基因IRS-1和β-actin溶解曲线分别在84℃和83℃获得稳定溶解峰，表明在该条件下，目的基因具有显著的特异性。如图3所示，由扩增曲线结果可知，基因IRS-1和β-actin扩增曲线跨度适中，线条光滑度适中，表明重复性良好。与对照组相比，模型组大鼠骨骼肌中IRS-1mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，黄地安消胶囊中剂量组骨骼肌IRS-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01），差异具有统计学意义，见表3。

图2 IRS-1和β-actin溶解曲线

图3 IRS-1和β-actin扩增曲线

表3 黄地安消胶囊对大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA的影响（±s，n=10）

表3 黄地安消胶囊对大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量g/kg IRS-1对照组 - 1.00±0.05**模型组 - 0.57±0.04参芪降糖颗粒组 1.08 0.71±0.05**黄地安消胶囊组 12 0.61±0.02黄地安消胶囊组 6 0.90±0.07**黄地安消胶囊组 3 0.59±0.05

2.4 对大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表达的影响 与对照组相比，模型组大鼠骨骼肌IRS-1表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，黄地安消胶囊组骨骼肌IRS-1蛋白表达具有不同程度的升高（P＜0.01），差异具有统计学意义，见表4，图4。

表4 黄地安消胶囊对大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表达的影响（±s，n=10）

表4 黄地安消胶囊对大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表达的影响（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量g/kg IRS-1对照组 - 1.31±0.06**模型组 - 0.68±0.05参芪降糖颗粒组 1.08 0.78±0.04**黄地安消胶囊组 12 0.88±0.07*黄地安消胶囊组 6 1.06±0.17**黄地安消胶囊组 3 0.77±0.05

图4 黄地安消胶囊对大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表达的影响

3 讨论

T2DM是一种临床常见的代谢紊乱性疾病，具有持续高血糖的显著特征，其发病机制复杂多样，多与遗传、自身免疫、饮食、药物等因素有关［8］。本实验选用自发性2型糖尿病模型GK大鼠为实验对象，其具有餐后血糖升高显著，空腹血糖升高不明显特点，同时具有和人类糖尿病相似的胰岛素抵抗，糖耐量降低等特征，已成为研究T2DM的理想模型［9-10］。由该处方比例可知成人每日所需生药量为51 g，由人、鼠体表面积换算比例得出大鼠每日所需生药量为4.59 g，每克浸膏所含生药量为3.06 g，故黄地安消胶囊高，中，低剂量组浸膏量为（12、6、3 g/kg）相当于临床剂量的8、4、2倍。

胰岛素作为体内唯一的降糖激素，由胰岛细胞分泌，对维持血糖稳定，促进机体正常生理功能具有至关重要的作用。胰腺组织损伤会直接引起胰岛细胞功能降低，胰岛素分泌的减少，进而促进高血糖的发生。病理实验结果表明黄地安消胶囊能够促进胰腺组织细胞表达，改善胰岛细胞功能，促进胰岛素分泌，缓解高血糖状态。ITT实验结果显示，与模型组相比，各给药组血糖均呈先降低后升高的趋势，表明黄地安消胶囊对胰岛素的利用率均存在一定程度的改善，促进了胰岛素的分泌。IRS-1是胰岛素信号传递的关键蛋白分子，广泛的分布于骨骼肌、肝脏、脂肪等组织，其直接决定着胰岛素与细胞膜受体底物结合的强弱［11］。在正常大鼠体内，IRS-1酪氨酸位点易发生磷酸化效应而活化，促进下游PI3K/Akt信号通路的激活，引发一系列级联反应，增加肌糖原，肝糖原的生物合成，加强机体对葡萄糖的吸收和利用，降低血糖含量［12-13］。当机体出现高血糖状态时，各组织器官IRS-1蛋白表达明显降低，与胰岛素的结合受阻，出现胰岛素信号通路传递被抑制，引发外周组织对葡萄糖消耗量的减少，从而加重糖尿病症状［14］。因此，本实验通过检测骨骼肌IRS-1的蛋白表达情况，发现黄地安消胶囊能够促进GK大鼠骨骼肌IRS-1mRNA和蛋白表达，有利于胰岛素与其相应受体相结合，增强胰岛素信号通路的传递，从而降低血糖水平，改善糖尿病症状。

综上所述，本实验结果表明黄地安消胶囊对GK大鼠血糖含量具有一定的降低作用，其机制可能与黄地安消胶囊改善胰岛细胞功能，促进骨骼肌组织IRS-1蛋白表达，增加胰岛素与IRS-1受体蛋白结合，增强胰岛素信号通路传递有关。