IRE1α-JNK通路对早期非酒精性脂肪性肝病作用研究

吴鹏波 王希君 吴晓曼 陈红光 谭诗云 夏洪淼

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是一种无过量饮酒史，由各种致病因素导致肝脏以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征。目前认为内质网应激、炎性反应、细胞凋亡、自噬水平紊乱等多种因素参与NAFLD发展[1～3]。

近年来研究发现，内质网应激通过未折叠蛋白反应参与NAFLD发生、发展[4]。肌醇依赖酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)是一种内质网跨膜蛋白，作为细胞未折叠蛋白反应重要传感器，在NAFLD 疾病进程中发挥着至关重要的作用[4]。活化的IRE1α通过多条信号通路促进异常蛋白质的降解、保证新生蛋白质正确折叠。近年来研究发现，IRE1α-JNK信号通路是调控细胞内质网应激后细胞命运转归的关键环节[5]。不同NAFLD中细胞内质网应激强度不同，不同强度的内质网应激对细胞命运转归影响不同[4]。因此本研究探讨IRE1α-JNK通路对早期非酒精性脂肪肝病小鼠模型影响。

材料与方法

1.材料:(1)试剂：高脂饲料自制(高糖高脂饲料组成: 基础饲料66.5%，蔗糖 10%，猪油20%，胆固醇3.4%，胆酸钠0.1%)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)均购自南京建成生物工程有限公司；IRE1α、JNK、p-JNK、Bcl-2、caspase-3、Bax、LC3、Beclin-1一抗购自美国Sigma公司；二抗购自武汉三鹰生物有限公司；(2) 动物：SPF级健康雄性C57/BL6小鼠由购自武汉大学动物中心，小鼠6～8周龄，体质量20～25g，实验动物饲养于SPF动物房，室温20～24℃，相对湿度约40%～60%。(3)主要仪器：石蜡切片机(日本Olympus公司), 普通光学显微镜(日本Olympus公司),电泳系统(美国Bio-Rad公司),透射电子显微镜(日本Olympus公司)。

2.动物分组及干预：将C57/BL6小鼠随机分为对照组、高脂饮食组、IRE1α-shRNA组、慢病毒空白载体组，每组5只；在造模前IRE1α-shRNA组，慢病毒空白载体组小鼠给予腹部肝区注射IRE1α-shRNA慢病毒载体及慢病毒空白载体100微升/次，连续3天，适应性饲养2天后进行后续实验。对照组给予正常饮食，其余组高糖高脂饮食诱导NAFLD，饲养3周。

3.HE 染色：实验结束后处死小鼠获取肝组织组织放入10%甲醛溶液中固定72h，石蜡包埋，切片机切4μm厚切片，经过脱蜡、脱水、苏木精染色、盐酸乙醇分化、伊红染色，再经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，在倒置显微镜下观察肝组织病变。

4.肝功能及炎性水平检测：处死小鼠后提心获取各组小鼠血清，南京建成生物有限公司试剂盒检测各组小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β水平。

5.电镜观察肝组织自噬结构：处死小鼠后获取肝组织，迅速获取大小约1mm3肝组织用预冷的4%戊二醛固定，经过PBS充分漂洗后1%饿酸固定，经过乙醇及丙酮处理脱水后包埋，采取醋酸铀-硝酸铅双重染色，最后透射电镜观察肝组织内自噬相关结构。

6.Western blot法检测蛋白表达：处死小鼠后获取新鲜的肝组织，碾磨并用裂解液裂解，水煮法制作蛋白样品。蛋白样品经过SDS-PAGE分离胶中电泳、转膜、切膜，加入相应的一抗孵育过夜，次日早晨加入二抗后孵育2h，显影定影检测各目标相对表达。

结 果

1.IRE1α-JNK通路变化：与对照组比较,高脂饮食组肝组织中IRE1α表达增加，高脂饮食组与空白载体组肝组织中IRE1α表达比较，差异无统计学意义；与模型组比较，IRE1α-shRNA组肝组织中IRE1α表达明显降低。与对照组比较,高脂饮食组肝组织中p-JNK表达增加，高脂饮食组与空白载体组肝组织中p-JNK表达比较，差异无统计学意义；与空白载体组比较，IRE1α-shRNA组肝组织中p-JNK表达明显降低。结果提示在造模过程中IRE1α-JNK通路激活，而IRE1α-shRNA慢病毒载体注射可以抑制IRE1α-JNK通路，详见图1。

图1 Western blot法检测IRE1α-JNK通路变化a.对照组；b.模型组；c.空白载体组；d.IRE1α-shRNA组

2.肝功能及炎性水平：与对照组小鼠比较，模型组小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明显升高(P均<0.05)；与空白载体组小鼠比较，IRE1α-shRNA组小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β明显升高(P均<0.05)，空白载体组与模型组小鼠血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，详见图2。

图2 各组小鼠肝功能及炎性水平a.对照组;b.模型组;c.空白载体组;d.IRE1α-shRNA组;与对照组比较，*P<0.01;与空白载体组比较， #P<0.05,##P<0.01

3.肝组织病理染色结果：对照组小鼠肝组织肝小叶结果正常，细胞无明显脂肪变性，无炎症及坏死；模型组和空白载体组可见肝小叶结构尚整齐，可见少量细胞脂肪变性，少许炎性细胞，未见明显的细胞坏死；与空白载体组比较，IRE1α-shRNA组肝脏组织可见肝小叶轻度紊乱，大量炎性细胞，肝细胞脂肪变性明显，详见图3。

图3 各组小鼠肝组织的病理学改变(HE,×200)A.对照组；B.模型组；C.空白载体组；D.IRE1α-shRNA组

4.电镜观察自噬结构：对照组肝细胞形态正常，偶见自噬小体或自噬溶酶体出现；模型组和空白载体组肝细胞出现轻度肿胀，线粒体轻中度空泡化，少许嵴消失，与正常对照组比较，肝细胞内自噬小体或自噬溶酶体增加；IRE1α-shRNA组肝细胞中度肿胀，线粒体上述病变加重，肝细胞中鲜见自噬小体或自噬溶酶体结构,详见图4。

图4 透射电镜观察小鼠肝细胞超微结构(×12000)A.对照组;B.模型组;C.空白载体组;D.IRE1α-shRNA组

5.凋亡及自噬相关蛋白表达:与对照组比较, 模型组和空白载体组肝组织内Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白无明显变化，而Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ均明显增加,P62明显降低，模型组和空白载体组上述蛋白表达比较，差异无统计学意义；与空白载体组比较，IRE1α-shRNA组肝组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显减少，而Bax、P62、caspase-3表达明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)，详见图5。

图5 Western blot法检测凋亡及自噬相关蛋白表达a.对照组；b.模型组；c.空白载体组；d.IRE1α-shRNA组

讨 论

目前国内学者认为内质网应激在NAFLD发展中扮演着重要的角色[6,7]。内质网通过激活未折叠蛋白质反应以保护由内质网应激所引起的细胞损伤，恢复细胞稳态。近年来发现不同程度的内质网应激对NAFLD发挥不同的作用[4]。在NAFLD早期，短暂(轻度)的内质网应激虽然直接诱导细胞凋亡，内质网应激可通过启动自噬等保护机制对抗凋亡，最终细胞即使承受内质网应激刺激，凋亡不会出现明显增加;而NAFLD晚期，长期(重度)的内质网应激可通过一方面可直接诱导细胞凋亡，另一方面内质网直接损伤细胞保护机制直接导致细胞凋亡率明显增加。IRE1及其介导的内质网应激——非折叠蛋白反应因被发现参与细胞应激后细胞存亡抉择而引起广泛的关注[8]。本研究发现通过注射IRE1α-shRNA慢病毒载体沉默IRE1α-JNK通路发现肝脏脂肪变性加重，组织中炎性细胞明显增加,血清炎性介质明显升高，提示IRE1α-JNK通路对NAFLD具有保护作用。而既往研究提示IRE1α-JNK在NAFLD中扮演有害角色，本研究结果与既往研究相矛盾[9]。

既往研究NAFLD时，动物模型制作多高脂饮食8周甚至以上[9～11]，而在本研究中动物仅高脂饮食3周。本研究反映IRE1α-JNK对早期NAFLD的作用，而既往的研究是IRE1α-JNK对晚期NAFLD的作用。故本研究与既往研究结果矛盾可能原因在于早晚期NAFLD中内质网应激程度不同，在NAFLD早期，适度的内质网应激通过IRE1α-JNK通路通过促进自噬抵抗细胞凋亡扮演有利的角色。凋亡和自噬作为一种维持机体自身稳定的基本生理机制,它们分别通过清除损伤、衰老与突变的细胞和降解错误折叠的蛋白质等途径来维持自身的稳态和各种器官及系统的正常功能[12～17]。内质网应激可通过调控自噬和细胞凋亡参与NAFLD发生、发展[13]。本研究发现早期NAFLD中IRE1α-JNK通路激活后自噬水平增高，凋亡无明显增加；抑制IRE1α-JNK通路后自噬水平降低，凋亡明显增加。

综上所述，IRE1α-JNK通路可能通过促进自噬对早期NAFLD起保护作用，然而IRE1α-JNK通路信号如何通路调控自噬有待于进一步探索。明确IRE1α-JNK通路在NAFLD中自噬调控的具体作用机制，将有利揭示自噬NAFLD中鲜为人知的一面，为NAFLD临床治疗及预防提供新的思路。