单侧前牙反牙合对三叉神经感觉主核背内侧部及丘脑腹后内侧核VGLUT 表达水平影响的研究

2020-12-24时铭鸿谢勉姣王冬梅李金莲王美青

口腔颌面外科杂志 2020年6期

时铭鸿，刘鑫，谢勉姣，王冬梅，李金莲，王美青 ,

（1. 新乡医学院第三附属医院口腔科，河南新乡 453000；2. 第四军医大学口腔医学院口腔解剖生理学教研室，陕西西安 710032；3. 中国人民解放军第960 医院口腔科，山东济南 250031；4. 第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室，陕西西安 710032）

异常咬合的主要神经生理、病理学特征之一为牙周本体感受器异常兴奋。牙周本体觉主要是由分布在牙周组织中的力感受器感受，其信号可以通过三叉神经中脑核（trigeminal mesencephalic nucleus，Vme）向中枢传递，口腔颌面部本体感觉信息的初级神经元位于Vme。本课题组的前期试验证明，单侧前牙反（unilateral anterior crossbite，UAC）可经牙周-Vme-多个运动性神经核团回路，激活多个运动相关神经核团的神经元。 Vme 神经轴突由到三叉神经感觉主核背内侧部（dorsomedial part of the trigeminal nucleus，Vpdm）的神经纤维投射，继而将咀嚼肌本体觉的信息传导至对侧丘脑腹后内侧核（ventral posteromedial thalamic nucleus，VPM）[1-4]，所以Vpdm 和VPM 可能是口腔颌面部本体感觉传导通路的重要组成部分。囊泡膜谷氨酸转运体1，2（vesicular glutamate transporter1，2，VGLUT1，2）被视为谷氨酸能轴突终末的特异性兴奋性神经递质标识物[5-7]。近年来，本课题组建立了可导致颞下颌关节出现退行性变的单侧前牙反（UAC）动物模型[8-9]。研究表明，UAC 可以导致Vme 高表达 VGLUT1[10-11]。那么UAC 是否可以引起Vpdm 及VPM 神经元的兴奋性变化、及高表达 VGLUT1，2 呢？本文检测了UAC 大鼠 Vpdm 及 VPM 中 VGLUT1，2 的表达变化情况，以探讨异常咬合的兴奋性冲动在三叉神经传导通路相关神经核团的神经投射传递情况及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

42 只 6 周龄雌性 SD 大鼠，体质量 160~180 g，由第四军医大学实验动物管理中心提供，动物饲养方式相同。实验方法与操作均符合第四军医大学实验动物管理中心使用规定。 6 只大鼠于下牙槽注射霍乱毒素 B 亚单位（cholera toxin B subunit，CTb，Sigma 公司，美国），跨节追踪实验，分为 UAC 组和对照组（n=3）。将其余 36 只大鼠随机分为 UAC 组和对照组，分为2、4 和8 周3 个时间点，每个时间点设3 只大鼠用于组织形态学观察，3 只用于实时定量 PCR 和 Western blot 检测。

1.2 UAC 模型的建立

采用本课题组此前报道的方法[10-11]。 UAC 组大鼠用戊巴比妥钠（上海信然生物科技公司，中国）麻醉后，在左侧上、下颌切牙处分别进行不良修复体的粘接：上颌不良修复体使用25 号通乳针，切割成 3 mm 的金属短管；用20 号通乳针制成一端有3~4 mm 长导板的下颌不良修复体，用钳子将导板压扁，导板与主管（5 mm 长）做成 45°角。用牙科粘接剂分别将上下颌不良修复体（套筒冠）粘接在左侧上下颌切牙上，上下修复体呈反关系。实验期间定期观察，确保不良修复体没有脱落。

对照组大鼠进行相同的操作，但不粘接不良修复体。所有动物给予相同的饲养条件。

1.3 束路追踪

1.3.1 CTb 下牙槽神经注射 UAC 组3 只大鼠造模1 周后，采用本课题组报道的方法[10-11]，麻醉后切开大鼠左侧颌面部皮肤并切断咬肌，暴露出下颌支。用牙钻在下颌支钻开一个长宽约3 mm 的小骨窗，找到下牙槽神经，用微量进样器抽取6~8 μL 1%的CTb 水溶液，缓慢注入所暴露出的下牙槽神经内。盖住骨窗，缝合咬肌及皮肤。动物存活5 d 后取材。对照组动物在同一时间作相同处理。

1.3.2 生物素化葡聚糖胺注射采用本课题组报道的方法[10-11]，大鼠麻醉后，在立体定位仪上固定头部，钻开动物颅骨，将10%的生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran， BDA，Molecular Probes 公司，美国）用微量进样器注射入大鼠Vpdm 内，原位留针30 min，动物存活7 d 取材。

1.4 组织取材

免疫荧光组织切片标本取材，大鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，左心室插管进入升主动脉，300 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液冲洗血液，用含4%多聚甲醛及15%饱和苦味酸的0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2~7.4）约 500 mL 动物灌注固定。迅速取脑，并在上述相同的固定液中固定4 h（4 ℃），将其放置于含30% 蔗糖的 0.1 mol/L PB 中。制备厚度 25 μm 的冰冻组织切片，收集在含有适量0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液的6 孔板中。 Western blot 大鼠深度麻醉，迅速断头取脑，冰上迅速取出含有Vpdm、VPM 平面的组织，-80 ℃备用。进行实时定量PCR、Western blot 组织检测。

1.5 免疫荧光染色

取下牙槽神经注射CTb 动物的Vpdm 平面，做VGLUT1、CTb、神经元特异性标识物NeuN 的免疫荧光三标。兔抗 VGLUT1 IgG （1∶500，Synaptic System公司，德国）、小鼠抗 NeuN IgG（1∶1 000, Millipore 公司，美国）和山羊抗 CTb IgG（1∶2 000, List Biological公司，美国），室温条件下进行切片孵育，过夜；生物素标记的驴抗山羊 IgG （1∶200, Chemicon 公司，美国），室温条件下孵育切片3 h；Alexa488 结合的驴抗山羊 IgG（1∶300, Abcam 公司，美国）、Alexa594 结合的驴抗兔 IgG（1∶300, Abcam 公司，美国）和 Alexa647结合的驴抗小鼠 IgG（1∶300, Abcam 公司，美国）混合孵育切片6 h。所用稀释液是含5%驴血清、0.25%角叉菜胶、0.05%叠氨钠及 0.5% Triton X-100 的0.05 mol/L PBS。每只动物的切片每隔3 张选取1 张片子染色，反应结束后，裱片、封片，用激光共聚焦显微镜（Olympus 公司，日本）观察 CTb 注射同侧Vpdm 染色情况并拍照。随机选取10 张片子进行阳性细胞计数。

BDA 准确注射到Vpdm 的动物，取Vpdm 层面切片在加入 FITC-Avidin IgG（10 μg/mL,Molecular prbes公司，美国）的稀释液中孵育6 h。 VPM 层面切片兔抗 VGLUT1 IgG（1∶500, Synaptic System 公司，德国）、小鼠抗 NeuN IgG（1∶1 000, Millipore 公司，美国）室温过夜；FITC-Avidin IgG，Alexa594 结合的驴抗兔IgG（1∶300, Abcam 公司，美国）和 Alexa647 结合的驴抗小鼠 IgG（1∶300, Abcam 公司，美国）混合孵育切片6 h。用共聚焦显微镜观察BDA 注射对侧VPM染色情况并拍照。阳性细胞计数方法同上。

1.6 Western blot

动物深度麻醉后，冰上取Vpdm 和VPM 平面的组织放到含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂缓冲液的离心管中，超声裂解后静置。4 ℃，12 000 g 离心10 min，吸出上清液。用BCA 试剂盒进行蛋白含量的测定。配制分离胶和浓缩胶，每个孔缓慢加入30 μg 蛋白的样品；恒压80 V 跑胶30 min 后，调至恒压120 V，继续电泳，直到溴酚蓝跑到底部，电泳结束。4 ℃，恒流300 mA，转膜2 h。将转移膜放置在含有5% 脱脂奶粉的TBST 溶液中封闭1 h。孵育抗体，小鼠抗 VGLUT1（1∶500, Millipore 公司，美国），小鼠抗VGLUT2（1∶500,Millipore 公司，美国），小鼠抗 β-actin（1∶5 000, Abcam 公司，美国）。4 ℃过夜。TBST 溶液洗膜10 min，共3 次。用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000, Abcam 公司，美国），室温摇床慢摇孵育1~2 h。TBST 溶液洗膜10 min，共3 次。用ECL 试剂盒显示蛋白条带，进行最终的曝光和拍照。 Image J 软件分析所得到条带的密度。

1.7 实时定量PCR

移液器枪头和离心管去除RNA 降解酶处理。将Vpdm 和VPM 组织充分碎裂，加入1 mL TRIzol溶液，混匀置冰上2 h 后加入200 μL 三氯甲烷，震荡后静置 15 min。 4 ℃，12 000 g 离心 15 min，吸取上层水相至另一干净的离心管中。加入500 μL 异丙醇，震荡后静置 20 min。 4 ℃，12 000 g 离心 15 min，弃上清液，加入1 mL、4 ℃ 的75%乙醇, 轻轻震荡，4 ℃，7 500 g 离心 10 min 后去除乙醇，对 RNA 充分干燥。用焦碳酸二乙酯（dieth ylpyoo carbonate，DEPC）水溶解RNA，测定浓度。RNA 反转录的cDNA产物溶液最终用于实时定量PCR 检测。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 下牙槽神经-Vme-Vpdm-VPM 通路

在激光共聚焦显微镜下观察可见，CTb 标记的Vme 神经元轴突终末在Vpdm 神经元周围表现为VGLUT1 免疫阳性，UAC 组 VGLUT1 的表达高于对照组（图1）。阳性细胞计数结果表明：UAC 组 CTb单标阳性细胞、CTb 和NeuN 双标阳性细胞数，CTb、VGLUT1 和 NeuN 三标阳性细胞数，以及 CTb、VGLUT1 和NeuN 三标阳性细胞占CTb 单标阳性细胞数的百分比均显著高于对照组（图2）。在Vpdm 成功注射BDA 大鼠（图 3A）的对侧 VPM，可观察到BDA 标记的轴突终末投射（图3B），BDA 轴突分布在VPM 神经元周围，与表达VGLUT1 免疫阳性的Vpdm 神经元有轴突终末接触；但是阳性细胞观察结果和计数结果，均未显示UAC 组和对照组之间有明显的差异（图 4、5）。

图 1 下牙槽神经注射CTb 动物的Vpdm 处CTb、VGLUT1 和NeuN三标情况Figure 1 Triple-immunofluorescence histochemistry for cholera toxin B subunit (CTb), vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) and NeuN in Vpdm from animals injected with CTb in the inferior alveolar nerve

2.2 Vpdm 和 VPM 内 VGLUT1，2 的表达

图3 Vpdm 定点注射BDA（A）后对侧VPM 处BDA 的表达情况（B）Figure 3 Injection of biotinylated dextran BDA at Vpdm (A) and the BDA positive fibers at the contra-lateral VPM(B)

图4 UAC 实验组和对照组之间Vpdm 处注射BDA 后对侧VPM处 BDA、VGLUT1 和 NeuN 三标图比较Figure 4 Triple-immunofluorescence histochemistry for biotinylated dextran (BDA), vesicular glutamate transporter 1(VGLUT1)and neuronal nuclei (NeuN)at contralateral side VPM,which were compared between the UAC group and the control group after BDA injected at Vpdm

图2 UAC 实验组和对照组Vpdm 染色结果比较Figure 2 Comparison of the Vpdm staining between UAC and control group

实时定量PCR 结果表明，2~8 周的各时间点，UAC 组 Vpdm 中VGLUT1 mRNA 表达水平均高于同期对照组（P<0.05），VGLUT2 mRNA 表达水平则没有显著差异（图 6）；UAC 组 VPM 中 VGLUT1，2 的mRNA 表达与对照组均无显著差异（图7）。

Western blot 检测结果显示，2~8 周的各时间点，UAC 组Vpdm 中VGLUT1 蛋白表达在各个时间点均高于同期对照组（P<0.01，图 8）；但 VPM 的VGLUT1,2 蛋白表达与对照组相比，均无显著差异（图 9）。

3 讨论

图5 UAC 实验组和对照组VPM 染色结果比较Figure 5 Comparison of the VPM staining between UAC and control groups

图6 2、4 和8 周时间点对照组和UAC 组的Vpdm 中实时定量PCR 检测的VGLUT1，2 的mRNA 表达水平比较Figure 6 Comparison of the mRNA expression level of VGLUT1,2 in Vpdm between control and UAC group at 2, 4, and 8 weeks detected by real-time PCR

图7 2、4 和8 周时间点对照组和UAC 组的VPM 中实时定量PCR 检测的VGLUT1，2 mRNA 表达水平比较Figure 7 Comparison of the mRNA expression level of VGLUT1,2 in VPM between control and UAC group at 2, 4, and 8 weeks detected by real-time PCR

图8 2、4 和 8 周时间点对照组和UAC 组的Vpdm 中 Western blot检测的VGLUT1 蛋白表达水平比较Figure 8 Comparison of the expression level of VGLUT1,2 protein in Vpdm between control and UAC group at 2,4,and 8 weeks detected by Western blot assay

图9 2、4 和 8 周时间点对照组和 UAC 组的 VPM 中 Western blot检测的VGLUT1，2 蛋白表达水平比较Figure 9 Comparison of the expression level of VGLUT1,2 protein in VPM between control and UAC group at 2, 4,and 8 weeks detected by Western blot assay

牙周本体觉是一种非常重要的咬合感觉，咬合本体觉信息主要通过Vme 神经元向中枢传递。Vme 神经元是唯一位于中枢的初级神经元，Vme 轴突有向同侧Vpdm 的投射。VPM 是感觉信息向皮层传递的重要中继站[12]，接受来自Vpdm 的传入纤维[13]。在UAC 的刺激下，Vpdm 是否可以被激活，进而将兴奋性信号传递至VPM，以VGLUT1,2 的途径导致其兴奋，影响口腔颌面部感觉信息的传递，是学研究所关注的重要内容之一。谷氨酸在三叉系统各级神经元间兴奋性突触传递中发挥了重要作用。VGLUT 可分为 VGLUT1、VGLUT2 和 VGLUT3 3 种亚型，VGLUT1 和VGLUT2 被视为谷氨酸能轴突终末的特异性标识物，其表达水平的变化可用来说明谷氨酸能神经元兴奋性突触传递的变化。 Vme表达 VGLUT1 而不表达 VGLUT2[2]；Vpdm 则既表达 VGLUT1，又表达VGLUT2[13]。本课题组以往的研究发现，UAC 可以促进Vme 神经元表达VGLUT1，即产生兴奋性信号，被激活的Vme 通过兴奋三叉神经运动核、面神经核、副神经核、舌下神经核等处的神经元，导致咀嚼肌、镫骨肌、胸锁乳突肌及舌肌等相关肌活动异常[10-11]。

本文通过采用下牙槽神经注射CTb 及在Vpdm注射BAD 的束路追踪技术，以免疫荧光三标的方法，印证了文献中所报道的下牙槽神经-Vme-Vpdm传导通路以及Vpdm-VPM 传导通路的存在[1-4]。同时采用形态学、阳性细胞计数结合Western blot 和实时定量PCR 等方法进行研究。结果表明：UAC 异常咬合可以上调Vpdm 中VGLUT1 的蛋白表达水平，使其兴奋，表现为VGLUT1 的mRNA 表达水平增高。本文 CTb 注射实验显示，Vpdm 有来自 Vme 的投射，而且CTb+VGLUT+NeuN 的三标阳性细胞数在UAC 组明显增加，这说明UAC 可能通过兴奋Vme（表现为该部VGLUT1 的mRNA 表达水平增高），并通过VGLUT1（蛋白）使Vpdm 神经元兴奋（表现为该部VGLUT1 的mRNA 表达水平增高）。本课题组曾预期，兴奋的Vpdm 神经元可将兴奋性信号通过VGLUT1（蛋白）传递到对侧VPM，但通过形态学和阳性细胞统计、Western blot 检测，在蛋白水平上，没有发现 UAC 组 VPM 中 VGLUT1 和 VGLUT2 的高表达，进一步采用实时定量PCR 检测方法研究显示，UAC 组 VPM 中 VGLUT1,2 的 mRNA 表达水平均未见明显增高，这说明UAC 可通过Vme 兴奋导致Vpdm 兴奋，但该兴奋性信号可能并没有通过VGLUT1,2 继续上传到 VPM。因此，UAC 异常咬合所引起的由VGLUT1 介导的兴奋性信号，可能主要在与Vme 有直接突触联系的神经核团（如上文所述三叉神经运动核、面神经核、副神经核、舌下神经核）之间传递，有关结论尚需要采取电生理等方法进一步研究证实。

本文及本课题组之前报道的研究结果[1-2]提示：UAC 所致Vme 兴奋性神经冲动可能更多地导致与低级中枢信号传递相关症状的出现，而向高一级中枢传递的情况尚待进一步论证（图10）。这提示：在临床诊疗一些与异常咬合所致神经活动相关问题时，需要重点关注与低级中枢支配相关的症状。