低氧状态下HIF-1α 对骨细胞凋亡的影响

宋熙雯， 唐 燚， 宋朝卉， 胡 秀， 洪超越， 蔡 昀， 康非吾

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科，上海 200072）

骨细胞由于深嵌于细胞外基质中，所以尽管其含量在骨组织细胞中最为丰富， 但被了解程度却较低[1]。 在骨细胞被认为是骨骼健康所必需的活性细胞之前， 人们认为所有的活动都发生在骨骼表面，而不是骨骼内部[2]。 然而，由于骨细胞在骨基质中的位置，以及其广泛的树突状网络结构，使得它们能够与血管和骨表面相互沟通。 因此，在合成和分解代谢2 种情况下，骨细胞都非常适合对破骨细胞和成骨细胞进行适当的靶向调控。 随着研究的深入，骨细胞被认为是一种机械感觉细胞，其负责将骨内受到的机械力转化为化学信号，并通过连接成骨细胞和破骨细胞的方式来调控骨内平衡[3]。 有研究表明，骨骼去负荷降低了组织液的流量造成病理或生理上的局部循环不足， 这些都减少了氧的输送，使骨细胞处于缺氧环境中[4]。 骨折造成断端及邻近的骨膜和血管受损或中断， 导致骨皮质血液循环降低约一半，骨组织血供减少，断端周围氧浓度可降低至0~2%[5]。 面对低氧环境，骨细胞可通过自身调节以适应低氧状态，从而调节骨骼的稳态[6]。

骨质疏松、骨关节炎、正畸牙移动和牙周炎的骨组织中均发现骨细胞凋亡，提示凋亡骨细胞可能参与骨改建[7-9]。凋亡骨细胞可以增加肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白介素-1（interleukin-1，IL-1）及IL-6 等促炎症因子的产生来促进破骨细胞生成， 也可通过刺激正常骨细胞分泌核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）来招募破骨细胞[10]。

作为骨骼相关组织和细胞在低氧条件下的主要调控因子，HIF-1α 可引发下游10 种基因的转录，包括血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）和整合素 β2（CD18）等，以帮助细胞适应缺氧环境[11]。例如，促红细胞生成素和血管生成化合物可导致血管生成增加，以便向缺氧组织输送氧气；糖酵解酶可以增加葡萄糖转化为能量的能力[12-13]。因此，HIF-1α 被认为是在缺氧条件下必不可少的细胞保护因子。 但HIF-1α 对骨细胞的影响目前仍然知之甚少， 本文拟探讨低氧状态下HIF-1α 对骨细胞系MLO-Y4 凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 实验对象及主要试剂

小鼠长骨骨细胞系MLO-Y4 （中国医学科学院细胞库）， 小牛血清 （calf serum，CS，Gibco 公司,美国）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS, Gibco 公司,美国），α-MEM 培养基（南京凯基公司，中国），Optic-MEM 培养基（Gibco 公司，美国），Cocl2（Sigma 公司，美国），细胞增殖/毒性检测试剂盒（cell counting Kit-8，CCK-8， 碧云天生物技术研究所， 中国），Lipofectamine 3 000 转染试剂盒 （L3 000 015，Invitrogen 公司，美国），TRIzol 试剂（Takara 公司，日本）、逆转录试剂盒（Takara 公司，日本），RT-qPCR 试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，中国），Western blot 试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）。

1.2 细胞培养与处理

取适量CoCl2粉末， 用去离子水将其浓度溶解至100 mmol/L，随后用完全培养液稀释至所需实验浓度（100、200、300、400 μmol/L）， 刺激 MLO-Y4 细胞，建立体外低氧骨细胞培养体系。 将MLO-Y4 细胞接种于 α-MEM 完全培养液 （含 5%FBS、5%CS、1%双抗）中，并置于 5%CO2、20%O2、饱和湿度、37 ℃的细胞培养箱内孵育，每48 h 换液，待细胞汇合至70%~80%融合时， 用 0.25%胰蛋白酶消化并以1∶3传代。 将实验对象分为3 组， 分别是低氧转染组（CoCl2+siHIF-1α）、Cocl2组及对照组。

1.3 CCK-8 实验

将MLO-Y4 细胞按每孔2×103个的密度接种于96 孔板中，细胞贴壁24 h 后，分别设置复孔加入含100、200、300、400 μmol/L CoCl2的完全培养液，将孔板置于培养箱中培养。 24 h 及48 h 后，按照说明书，于每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂后在细胞培养箱中避光孵育2 h， 酶标仪检测细胞在450 nm 处的吸光度值。 对照组加入等体积不含CoCl2的完全培养液。 根据实验结果筛选出体外模拟低氧环境合适的药物浓度。

1.4 siRNA 转染实验

选择对数生长期细胞并按照2×104个/孔的密度种板，培养24 h，待细胞密度达80%时，用Optic-MEM 培养基分别稀释Lipofectamine 3 000 和siRNA，并按 1∶1 的比例充分混匀， 室温孵育 5 min。 在 200 μmol/L CoCl2的作用下，MLO-Y4 细胞转染 siHIF-1α，培养孵育 24 h。

1.5 RT-qPCR

MLO-Y4 细胞在细胞培养箱中培养24 h 贴壁后，用 200 μmol/L CoCl2刺激 24 h，利用 TRIzol 试剂提取细胞总RNA， 并测定样品的浓度和纯度，逆转录为cDNA， 然后通过实时荧光定量PCR 反应，检测MLO-Y4 细胞HIF-1α 及相关凋亡基因的表达。本实验所需PCR 引物均由上海生工生物工程公司设计合成，PCR 引物设计见表1。 加入100 nmol/L HIF-1α siRNA 转染， 并用 200 μmol/L CoCl2刺激24 h 后，提取总RNA 并进行RT-qPCR，检测 CoCl2作用下HIF-1α 对MLO-Y4 细胞凋亡相关基因表达的影响。

1.6 Western blot 分析

用200 μmol/L CoCl2化学模拟低氧刺激MLOY4 细胞 24 h， 加入 100 nmol/L HIF-1α siRNA 转染24 h，收集各组细胞，提取总蛋白。 细胞培养皿中加入 2×上样缓冲液（loading buffer）裂解细胞，金属浴100 ℃煮沸 5 min， 于 4 ℃、12 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液于-80 ℃保存待用。 十二烃基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （sodium dodecyl sulfate polyacryla mide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白， 湿转法将凝胶上的蛋白转至硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane，NCM） 上，5%脱脂牛奶室温封闭 2 h 后，加入鼠抗 HIF-1α（1∶300）、兔抗Caspase-3（1∶500）、兔抗 cleaved-Caspase-3（1∶500）、兔抗 JNK（1∶500）、鼠抗 β-actin（1∶1 000）4 ℃下孵育过夜。 TBST 振荡洗膜3 次，分别加入二抗抗鼠和抗兔的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的 IgG（1∶1 000），室温孵育 1 h，洗膜后 ECL 显影、成像。

1.7 统计学分析

所有实验重复3 次， 实验数据采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析。 数据用平均值±标准差（）表示，采用单因素方差分析比较多组间差异，P<0.05 为差异有统计学意义。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果

2.1 低氧对MLO-Y4 细胞增殖的影响

MLO-Y4 细胞被作用以不同浓度的CoCl2在不同时间点的CCK-8 实验结果（图1）表明，当作用24 h时，200 μmol/L CoCl2处理组与对照组相比，可显著降低MLO-Y4 细胞的增殖率，且差异具有统计学意义（P<0.01）；当作用 48 h 时，100 μmol/L CoCl2处理组与对照组相比， 可以显著降低MLO-Y4 细胞的增殖率，差异具有明显的统计学意义（P<0.001）。考虑到CoCl2细胞毒性的影响， 后续实验中选取200 μmol/L CoCl2作用24 h 作为主要的实验条件。

2.2 低氧状态下MLO-Y4 细胞的凋亡情况

Hoechst 33 342 染色结果（图 2A）显示，与对照组相比，MLO-Y4 细胞在 200 μmol/L CoCl2作用下表现为细胞核固缩，镜下呈强蓝色荧光，凋亡比例高于对照组，且差异有统计学意义（图2B，P<0.01）。TUNEL 染色结果（图 2A）显示，200 μmol/L CoCl2组MLO-Y4 细胞中深染棕黄色细胞核较多， 凋亡比例高于对照组，且差异具有统计学意义（P<0.001，图2C）。 结果表明 200 μmol/L CoCl2可诱导 MLO-Y4细胞凋亡。

2.3 低氧状态下MLO-Y4 细胞表达HIF-1α 及凋亡相关基因的mRNA 和蛋白表达情况

RT-qPCR 结果（图 3A）显示，在 200 μmol/L CoCl2作用下，MLO-Y4 细胞促凋亡基因Caspase-3 mRNA 表达量增加 （P<0.01）， 抑凋亡基因 Bcl-2 mRNA 表达量低于对照组（P<0.01），差异均有统计学意义。 细胞免疫荧光结果 （图3B-D） 显示，在200 μmol/L CoCl2作 用 下 ，MLO-Y4 细 胞 HIF-1α、Caspase-3 蛋白荧光明显强于对照组， 蛋白荧光阳性细胞数明显高于对照组， 且差异具有统计学意义（P<0.001）。 Western blot 结果（图 3E、F）显示，200 μmol/L CoCl2组细胞 HIF-1α 蛋白表达量高于对照组（P<0.05），且 Caspase-3 及 cleaved-Caspase-3的蛋白表达量也高于对照组（P<0.01）。 结果表明低氧能够使HIF-1α 表达上调，同时增加促凋亡基因的表达。

2.4 低氧状态下siRNA 转染对MLO-Y4 细胞HIF-1α、Caspase-3 表达的影响

RT-qRCR 结果（图 4A、B）显示，低氧转染组的HIF-1α 的 mRNA 表达低于低氧组（P<0.01），表明转染成功； 低氧转染组Caspase-3 的表达量也显著低于低氧组（P<0.001）。 Western blot 结果显示（图 4C-F）， 低氧转染组的 HIF-1α、Caspase-3 及 cleaved-Caspase-3 蛋白均表达低于低氧组。结果表明低氧状态下 siHIF-1α 转染可以降低 HIF-1α 的表达 （P<0.01）、Caspase-3 的表达（P<0.01）和活化（P<0.001），减少MLO-Y4 细胞凋亡。

图1 不同浓度CoCl2 作用不同时间后对MLO-Y4 细胞增殖活性的影响Figure 1 Effects of concentration of CoCl2 and time on proliferation activity of MLO-Y4 cells

图2 CoCl2 对MLO-Y4 细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of CoCl2 on apoptosis of MLO-Y4 cells

3 讨论

作为机械感应和传导细胞，骨细胞缺氧主要由非负载和骨折引起，骨细胞废用后会快速缺氧。 在正畸-正颌联合治疗中，“外科先行”正颌手术治疗方法较传统“正畸-正颌-正畸”治疗方法能明显加速正颌术后正畸牙的移动，缩短治疗疗程[14]。在正颌手术中，骨切开术创造了局部类骨折的环境，阻断了手术区域的局部血液供应。 此外，在骨质疏松、骨关节炎等疾病中骨髓腔内血流量灌注减少，这些都减少了骨组织中的氧气运输[15-16]。 体内截骨术模型显示，骨切开后局部HIF-1α 阳性骨细胞比例快速增加[17]。体外实验也证明， 在体外缺氧环境下类骨细胞系MLO-Y4 细胞 HIF-1α 表达上调[18]。 Co2+作为亚铁螯合酶的底物，在细胞中能取代Fe2+，从而竞争性结合血红蛋白，使HIF-1α 的表达稳定上调。 因此，本研究使用CoCl2体外模拟低氧环境[19]。 本研究用CoCl2体外模拟骨细胞系MLO-Y4 细胞的缺氧环境，发现200 μmol/L CoCl2可显著降低 MLO-Y4 细胞的增殖率，并呈浓度和时间依赖性。

无论在生理还是病理情况下，骨改建均初始于破骨细胞的募集，被募集的破骨细胞清除局部死亡细胞，介导骨吸收，开始周围骨基质的重塑[20]。 在破骨细胞形成过程中， 骨细胞作为RANKL 必不可少的细胞来源，其表达量高于成骨细胞和骨髓基质细胞[21]。在骨切开术中，凋亡骨细胞的迅速增加甚至早于破骨细胞出现，提示骨细胞凋亡可引发破骨细胞前体募集，开始骨吸收[22]。骨细胞凋亡增加导致可生成骨保护素（osteoproteg erin，OPG）的骨细胞数量减少，并刺激相邻的活性骨细胞生成更多的RANKL 和血管内皮生长因子[23]。随着研究的深入，凋亡骨细胞在骨重建中的作用越来越受到关注。 骨细胞凋亡主要由骨骼卸载、雌激素缺乏、疲劳损伤及缺氧引起。本研究发现， 在 200 μmol/L CoCl2作用下，MLO-Y4细胞TUNEL 染色阳性细胞数多于对照组， 细胞凋亡增加， 促凋亡基因Caspase-3 的mRNA 和蛋白表达均上调，抑凋亡基因Bcl-2 表达下降，表明200 μmol/L CoCl2体外模拟低氧环境可增加MLO-Y4细胞凋亡。 凋亡相关基因和酶可调节细胞凋亡，Caspase-3 作为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族中的一员，能降解多种关键的细胞内蛋白，还能激活其他潜在的酶，促使细胞凋亡[24]。

图 3 CoCl2 对 MLO-Y4 细胞 HIF-1α、Caspase-3 mRNA 及蛋白表达的影响Figure 3 Effect of CoCl2 on the expression of mRNA and protein of HIF-1α and Caspase-3 in MLO-Y4 cells

图 4 200 μmol/L CoCl2 作用下 siRNA 转染对 MLO-Y4 细胞表达 HIF-1α、 Caspase-3 的影响Figure 4 Effect of siRNA transfection with 200 μmol/L CoCl2 on expression of HIF-1α and Caspase-3 in MLO-Y4 cells

HIF-1α 被广泛认为在骨形成中起正向保护作用，其可通过下游上百种基因的表达，应对局部组织和细胞的缺氧、缺血，并改变糖代谢和氧代谢的平衡[25]。 然而，HIF-1α 的部分缺失会导致软骨细胞和成骨细胞凋亡的减少[26]。 骨细胞作为成骨细胞系的终末细胞，深埋于骨陷窝内。 研究表明，骨陷窝内氧浓度低于10%，而这一氧浓度正是HIF-1α 的脯氨酸羟基化酶（prolyl hydroxylase, PHD）活性的关键阈值， 提示HIF 通路在普通骨细胞功能中的重要性[26]。在骨细胞中敲除 PHD 后， 其 HIF-1α 表达上调，细胞体积与表面积减小，并有明显的凋亡特征[27]。本研究发现，siHIF-1α 转染后，MLO-Y4 细胞 HIF-1α 表达下降， 促凋亡基因Caspase-3 的表达量也表现为下降趋势， 细胞凋亡减少。 当敲除骨细胞中的von Hippel-Lindau（VHL）时，骨细胞形态改变，凋亡增加，这与本研究结果一致[28]。 HIF-1α 在其他细胞中对细胞凋亡的正向调控作用也有报道，其可通过线粒体途径诱导人子宫骶韧带成纤维细胞凋亡[29]。

由于体外给予CoCl2不能真实地反映体内细胞在低氧环境下的复杂氧变化，且骨细胞在体内深埋于骨基质中， 其复杂的三维结构在体外难以模拟；同时，在体内低氧环境下，细胞还受到炎症、渗透压、 酸碱度等其他复杂因素的影响，HIF-1α 对骨组织环境下其他骨组织细胞的影响十分复杂。 因此，HIF-1α 在骨细胞凋亡中的影响还需要进一步的研究。

综上所述，本实验表明低氧可上调骨细胞HIF-1α表达，促进骨细胞凋亡，且 HIF-1α 在MLO-Y4 细胞凋亡中起正向调节作用。 这加深了对骨改建局部低氧环境中低氧作用的了解， 为全面了解HIF-1α 对骨组织细胞多方面的作用提供了依据，从骨细胞角度为临床上探究正颌术后正畸牙加速移动提供可能的内在机制，对认识骨切开术、骨质疏松、骨关节炎等生理和病理现象提供了一定的指导。