载microRNA-15b-5p 壳聚糖纳米粒子的制备及其对大鼠BMSCs 成骨分化影响的初步研究

刘 扬， 吴珺华

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院口腔修复教研室，上海 200072）

在临床治疗中，外伤、肿瘤切除术、感染性疾病、 先天畸形等原因造成的颌面部骨缺损会影响患者正常的面部外形及功能。 此类患者大多要通过骨移植的方式修复缺损的骨组织， 从而恢复美观及功能。 但在骨修复的过程中，仅通过骨移植材料来恢复骨组织缺损的方法具有恢复时间较长，愈合成骨欠佳等缺陷。 因此，使用生物因子来促进成骨具有临床应用价值。 骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨发生和骨改建的物质基础，是骨组织不断更新的活动中最重要的细胞之一。 骨吸收和骨形成的动态平衡是骨组织改建的基础[1]。研究BMSCs 成骨分化调节过程， 对于探索骨组织疾病的发生机制具有重要意义。 MicroRNAs（miRNAs）是大小约 21~25个碱基的非编码单链小分子RNA，其作为基因表达转录后的调节因子，在多种人类疾病（如神经退行性疾病、代谢性疾病）中起着重要的作用[2]。 已有大量文献证明miRNA 靶标于多个成骨分化和成骨细胞功能相关的转录本，从而控制成骨细胞分化和骨形成。我们发现，在BMSCs 成骨分化前后，miR-15b-5p 表达差异明显，由此猜测该基因可能参与调节成骨分化。

在以往使用miRNA 进行基因治疗的研究中，有研究者通过对miRNA 进行体外改性修饰以增加其稳定性，并直接应用于肿瘤治疗[3]。 另有研究使用脂质体递送剂[4]和阳离子载体树枝状聚甘油胺[5]等方式递送miRNA。 但是，这些递送方式仍有效率较低、稳定性欠佳和作用时间短等缺点。 在阳离子多聚物中，壳聚糖纳米粒子基因载体因具有优良的生物相容性和目的基因保护能力，在骨组织疾病的治疗中具有更大的优势。

本文研究了miR-15b-5p 在大鼠BMSCs 成骨分化中的影响，并构建具有良好生物相容性及高负载能力的壳聚糖/miR-15b-5p 基因载体，探讨其促大鼠BMSCs 成骨分化的能力，为后续颌骨缺损修复的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 原代BMSCs 的分离、培养

取3 周龄的SD 大鼠，钝性分离其股骨和胫骨，使用咬骨钳剪去长骨骨骺端， 用1 mL 注射器吸取培养液，冲洗骨髓腔，直至其骨髓冲出后表面呈白色。 使用微量移液器吹打至均匀后，用200 目细胞筛网进行过滤后培养。 培养基采用含有10%胎牛血清（Gibco 公司，美国）、1%青霉素、链霉素溶液的α-MEM（Hyclone 公司，美国）。细胞置于 60 mm 细胞培养皿中，在 37 °C，5%CO2环境下培养，3 d 后更换培养基，随后每隔2 d 更换1 次培养基。待细胞密度达到70%~80%时进行传代。 所有后续实验均选用第3 代细胞。

1.2 成骨分化

将 1×105个/mL 细胞浓度的 BMSCs 接种至60 mm 的培养皿中， 采用10%胎牛血清的α-MEM培养液培养，每皿4 mL，放置于37 ℃培养箱中培养。接种后次日，显微镜下确认细胞贴壁且状态良好。去除培养基并用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗。 换成骨分化诱导培养基（完全培养基内加入 10 mmol/L β-甘油磷酸盐、0.1 μmol/L 地塞米松和50 μmol/L 抗坏血酸）培养细胞，每2~3 d 换液。

1.3 茜素红染色

在成骨诱导14 d 及21 d 后，弃去培养液， PBS清洗 3 次， 4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素红染液（Sigma 公司，美国）染色 5 min，PBS 清洗后吸干液体，倒置显微镜下拍照。 加入1 mL 2%十六烷基吡啶洗脱 10 min， 每孔吸取 200 μL 置于 96 孔板中，酶标仪测定各样本在562 nm 处的吸光度值。

1.4 miR-15b-5p 及成骨相关基因检测

使用TRIzol（Roche 公司，瑞士）提取细胞总 RNA，利用 Prime Script®RT 反转录试剂盒（Roche 公司，瑞士） 合成cDNA， 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨诱导不同时期miR-15b-5p 及成骨相关基因的表达。 相关基因引物序列见表1。

1.5 miR-15b-5p 转染 BMSCs

以 2 ×104个/mL 的细胞浓度将 BMSCs 接种至35 mm 的培养皿中， 待其60%融合后更换miRNA转染试剂盒配置的培养基，在需过表达miR-15b-5p的转染液中添加miR-15b-5p 模拟物（锐博公司，中国），对照组添加随机序列的对照模拟物。 分别将转染液添加至培养皿中，每皿3 mL。 转染24 h 后，取出培养皿，去除培养液后用PBS 清洗，更换成骨诱导培养基。 培养 3 d 后，qRT-PCR 检测其成骨相关基因表达情况。

1.6 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子的制备

将 3 μL 浓度为 20 μg/μL 的 miR-15b-5p 模拟物加入1.2 mL 浓度为0.84 mg/mL 的三聚磷酸盐溶液（Sigma 公司, 美国）中，吹打混匀。 将 3 mL 浓度为2 mg/mL 壳聚糖盐酸盐溶液（澳兴公司，中国）置于磁力搅拌器上持续搅拌，逐滴加入三聚磷酸盐溶液和miR-15b-5p 模拟物混合液。通过上述方法制备出壳聚糖/miR-15b-5p 质量比分别为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 和 100∶1 的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子。

1.7 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子表征的测定

1.7.1 包封率测定 取上述6 种壳聚糖/miR-15b-5p 溶液各200 μL，于高速冷冻离心机上离心，离心速度为12 000 r/min，离心30 min；取上清液，使用Ribogreen 荧光检测试剂盒（Thermo 公司，美国）检测，在激发波长为485 nm、发射波长为530 nm 处检测各组分液体的荧光强度。 按以下公式计算包封率：

包封率（%）=（W0-W1）/W0 ×100%

W0： 制备 200 μL 悬液时加入的 miR-15b-5p 总量；W1：200 μL 溶液中未被壳聚糖包封的 miR-15b-5p 的量。

1.7.2 粒径及形貌测定 取上述壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子溶液适量，加去离子水稀释至2 mL。 用激光粒度分析仪检测其强度平均径（Z-average）、强度粒度分布及多分散系数（polydispersity index，PDI）。采用铝箔作为载体， 将其用双面胶固定于载物盘上， 将壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子溶液滴在铝箔上，待自然干燥后蒸金，于扫描电镜下观察纳米粒子形貌。

1.7.3 细胞毒性测定 配置不同质量浓度的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子溶于完全培养基，取第3 代BMSCs 细胞悬液以 2×103个/孔的密度接种于 96 孔板中，加入完全培养基100 μL。 实验设置为对照组和上述不同质量浓度的纳米粒子组，每组各设置3 个复孔。于第1 天和第3 天使用CCK-8 试剂盒检测吸光度值。

1.7.4 体外转染 将Cy-3 标记的miR-15b-5p 模拟物使用以上方法制备得到壳聚糖纳米粒子，将其溶于无双抗培养基中，配置成miR-15b-5p 浓度分别为10、50、100、150 和 200 nmol/L 的转染液， 并将其转染 BMSCs； 培养 24 h 后，4′，6-二脒基-2 苯基吲染色，荧光显微镜下观察。

1.8 纳米粒子在大鼠颅骨缺损修复中的运用

选用雄性 SD 大鼠 6 只，体质量 250~270 g。 将动物随机分为2 组（n=3），分别使用空白纳米粒子和壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子处理。用直径5 mm的环钻在大鼠颅中缝左右侧钻出2 个对称的圆形缺损[6]，并去除其中的骨块，将2 组纳米粒子悬液（含有0.5 nmol/L miR-15b-5p 模拟物的纳米粒子）用明胶海绵吸附后放置于骨缺损处，随后拉拢两侧骨膜覆盖植入材料后严密缝合。表皮创口用红霉素软膏外敷以防止感染发生。 术后8 周，通过腹腔过量注射麻药的方式使动物安乐死。 随后完整取出大鼠颅骨，0.9%氯化钠溶液将其冲洗后，置于4%多聚甲醛中固定。随后将固定好的组织进行Micro-CT 扫描及分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.9 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析， 数据以平均值±标准差（）的形式表示，使用 t 检验和单变量多因素方差分析进行统计学分析，当P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-15b-5p 在成骨分化中的作用

当 BMSCs 经成骨诱导液培养 7、14 d 后， 其成骨相关基因RUNX2、OSX 及OPN 表达均有明显升高（图 1A）。 当诱导时间达 14、21 d 后，茜素红染色结果显示， 诱导组钙结节形成量明显高于对照组，半定量结果与镜下观测相符（图1B）。上述结果证实BMSCs 成骨诱导成功。 进一步检测BMSCs 成骨分化过程中，miR-15b-5p 表达的改变。 结果显示，成骨诱导后，大鼠BMSCs 中的miR-15b-5p 的表达在7 d及14 d 时均明显高于对照组（图1A），呈现出与成骨相关基因同样的变化。

随后， 在BMSCs 中过表达miR-15b-5p 并成骨诱导3 d 后，检测成骨相关基因的表达情况（图1C）。过表达miR-15b-5p 后转染诱导组的成骨相关基因表达均明显高于对照组和诱导组。 上述结果表明，在大鼠BMSCs 中提高miR-15b-5p 的表达能够促进其成骨分化。

2.2 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子表征

包封率是衡量基因载体携带能力的重要指标。经检测，壳聚糖纳米粒子在壳聚糖/miR-15b-5p 质量比为 5∶1 时，其包封率为（39.09±0.65）%。 增大质量比后，包封率总体而言随壳聚糖/miR-15b-5p 质量比增大而提高。 当质量比达到20∶1 时，纳米粒子包封率达到（98.55±0.10）%。 再继续加大质量比后，包封率无明显增加（图2）。

图1 MiR-15b-5p 对BMSCs 成骨分化的影响Figure 1 Effect of miR-15b-5p on osteogenic differentiation of BMSCs

使用NICOMP 380 纳米粒度分析仪对不同质量比的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子进行动态光散射（dynamic light scattering，DLS）分析。结果显示，随着壳聚糖/miR-15b-5p 比值的增加，负载miR-15b-5p壳聚糖纳米粒子的粒径随之增大。 但同等体积及浓度下合成的空白壳聚糖纳米粒子的粒径在质量比为 5∶1~20∶1 的区间内体积变化不明显。 各组的多分散系数（polydispersity indices，PDI）与其配料比无明显相关性。 但各组的PDI 均＜0.5，说明其粒径分布较为集中（表2）。

使用CCK-8 试剂盒检测不同浓度的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子对BMSCs 的毒性效应。 检测结果表明， 不同浓度的纳米粒子与BMSCs 共同培养1 d 及3 d 后，其活性无明显影响，细胞增殖状态正常。

将不同配料比的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子根据其包封率，以相同的转染浓度（100 nmol/L）对BMSCs 行转染实验。 转染时间为 1 d 和 3 d。 qRTPCR 检测目的基因miR-15b-5p 的表达情况。结果见图 2。 根据 qRT-PCR 实验结果，转染 1 d 后，各组均使miR-15b-5p 的表达明显上调，其中质量比为10∶1和 20∶1 的壳聚糖纳米粒子转染 BMSCs 后， 目的基因表达上调较其他组更为明显（P<0.01）。 而在转染3 d 后， 质量比为20∶1 的壳聚糖纳米粒子促进目的基因表达的效果最为优异（图2）。

综合上述实验， 配料比为20∶1 制备的壳聚糖/miR-15b-5p 具有优良的负载效率及粒径。 扫描电镜检测此种配比纳米粒子的形貌， 纳米粒子形态均一，大小与DLS 检测结果吻合（图2）。

利用生物荧光Cy-3 标记miR-15b-5p 模拟物，并将其用于制备具有红色荧光标记特性的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子。分别以不同浓度转染BMSCs，转染时间为1 d， 显示细胞核使用DAPI 蓝染，miR-15b-5p 为红色点状荧光。 荧光显微镜下观察，各组细胞核周围均见红色荧光；随着miR-15b-5p 模拟物浓度增加，细胞核边缘红色点状荧光密度及强度增加，提示miR-15b-5p 成功转染进入细胞质中（图2）。

图2 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子的性能表征Figure 2 Characterization of chitosan/miR-15b-5p nanoparticles

表2 空白及载miR-15b-5p 壳聚糖纳米粒子粒径分析Table 2 Particle size analysis of blank and miR-15b-5p chitosan nanoparticles

2.3 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子促成骨分化能力

使用100 nmol/L 浓度的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子转染BMSCs 1 d 后， 成骨诱导3 d 和 7 d。qRT-PCR 检测成骨相关基因 RUNX2、OCN、OPN 和OSX 的表达（图 3A、B）。 使用壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子转染后， 其成骨相关基因表达上调明显，相较于成骨诱导组和对照组均有明显差异，且差异有统计学意义。

进一步检测成骨诱导培养至14 d 和21 d 的矿化结节形成情况，其结果见图3C。 使用壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子的转染诱导组，钙化结节数量明显多于对照组及诱导组。 使用氯化十六烷基吡啶洗脱后行半定量分析，壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子转染率为转染诱导组＞诱导组＞对照组。 结合qRT-PCR检测成骨相关基因结果，使用壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子转染大鼠BMSCs 后，其成骨分化能力提高。

大鼠体内颅骨实验中，通过Micro-CT 重建影像可见， 第8 周时对照组骨缺损区新骨生成较少，转染组骨再生明显。 第12 周时，两组均有较为明显的骨再生，但转染组的骨缺损修复面积明显大于对照组（图4A）。 对各组缺损区域行骨密度分析后，比较骨体积分数值（BV/TV），在 8 周和 12 周时，转染组的骨生成量均大于对照组（图4B）。 因此，证明了壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子具有良好的体内促成骨的能力。

3 讨论

成骨分化是骨生成和骨改建的关键步骤，是BMSCs 经骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞最终分化为骨细胞的生理过程。 该过程涉及细胞间和细胞内的多种信息调控， 包括信号通路、 转录因子、miRNA 等。 其中多个miRNA 早已被证实参与间充质干细胞成骨分化的调节。 该调节作用既有正向促成骨的miR-17-92 基因簇和miR-1a/miR-206 基因簇[7-9]等，也有抑制间充质干细胞成骨而促进其成脂向分化的 miRNA 如 miR-128[10]。 因此，筛选对 BMSCs有促进作用的miRNAs 是本研究的第1 步。 有研究者发现，miR-15b 在人BMSCs 成骨分化过程中表达上调[11]。在我们之前的研究中，对去势小鼠的颌骨行基因鉴定后发现，其miR-15b-5p 的表达与正常小鼠差异明显[12]。 因此，深入探讨 miR-15b-5p 在 BMSCs成骨分化过程中的作用具有重要意义。 本研究结果显示，miR-15b-5p 具有促进大鼠BMSCs 成骨分化的能力。 通过基因治疗的手段改变骨组织中miR-15b-5p 的表达有望促进成骨细胞生成，达到骨再生和修复的目的。

图3 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子对BMSCs 成骨分化的影响Figure 3 Effect of chitosan/miR-15b-5p nanoparticles on osteogenic differentiation of BMSCs

图4 壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子对大鼠颅骨缺损的影响Figure 4 Effects of chitosan/miR-15b-5p nanoparticles on skull defects in rats

作为自然界唯一的阳离子多糖，壳聚糖具有优良的理化性能及生物安全性能，是目前基因载体的研究热点。 在制备壳聚糖/核酸复合体时，两者的比值是影响纳米粒子性质的关键因素。 有研究使用壳聚糖负载小干扰RNA 并检测其基因敲除效率，使用分子量为20.45 kD 的壳聚糖,在N/P 比为80 时，具有最高的敲除效率[13]。另有学者使用分子量119 kD的壳聚糖在 N/P 比为 20 时，基因包封率最高[14]。 因此，对于不同分子量的壳聚糖，其合成所使用的壳聚糖/核酸的配比是不一样的。 一般而言，当壳聚糖分子量低时，需要更高的N/P 比来形成稳定的复合结构。 分子量高时，降低其N/P 比有助于提高转染效率[15]。 因此，本研究通过制备不同质量比的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子，并对其形貌、粒径及包封率进行评估，从而获得性能最优良的基因载体。 另外， 有学者使用壳聚糖纳米颗粒负载miR-199a-5p作用于人间充质干细胞并促进其成骨分化[16]，证实了壳聚糖纳米颗粒作为载体在成骨分化中的作用。通过对不同质量比的壳聚糖/miR-15b-5p 纳米粒子进行粒径形貌表征、 包封率测定和转染效率测定后，我们得出结论，当壳聚糖/miR-15b-5p 质量比为20∶1 时，纳米粒子具有最为优良的包封率、转染能力及应用于骨组织工程的潜能。

综上所述，miR-15b-5p 能够促进大鼠BMSCs成骨分化，使用壳聚糖纳米粒子负载该基因能够保护其免受核酸酶降解，延长作用时间，具有促进大鼠骨缺损修复的作用，为临床骨组织缺损及代谢疾病治疗带来新思路。