淋巴细胞活化基因3在恶性肿瘤中的意义及研究进展

高峰，刘子玲

吉林大学第一医院肿瘤中心肿瘤科，长春 130021

人们对恶性肿瘤免疫治疗的探索可以追溯到一百多年前，但由于肿瘤的异质性、免疫系统及肿瘤微环境的复杂性及肿瘤细胞的免疫逃逸能力等，恶性肿瘤的免疫治疗直到近年来才有了突破性进展[1]。免疫检查点是一系列共抑制配/受体通路参与维持机体免疫稳态、自身免疫耐受与抗肿瘤作用之间的平衡，因为它们平衡了共刺激信号并防止了过度的免疫反应。肿瘤可以利用免疫检查点通路实现免疫逃逸，尤其是逃避针对肿瘤特异性抗原的T细胞免疫反应[2]。抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）呈递的抗原肽-主要组织相容性复合体（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）能够诱导T细胞活化，但免疫检查点通路发出的负性信号不仅会减弱T细胞活化，还会促进T细胞的功能失活，导致无反应和耐受状态[3-4]。于是免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）疗法应运而生。随着免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）取得重大进展并逐步应用于临床，不同机制、不同环节的免疫靶点也相继被挖掘。作为最受关注的新兴免疫靶点之一，淋巴细胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG3）已经初显应用前景和临床价值。本文就LAG3的生物学特性及其在肿瘤免疫治疗中的研究进展作一综述。

1 LAG 3的生物学特性

1.1 LAG 3的结构

LAG3（CD223）是一种由498个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）成员，对T细胞的功能有多种生物学影响[5]。成熟的LAG3包括4个部分：疏水前导区、细胞外区域、跨膜区和胞质区，其中细胞外区域由4个免疫球蛋白超家族样结构域（D1～D4）组成，与CD4高度同源，但其与MHCⅡ类分子的亲和力较CD4高约100倍[6]。LAG3独特的胞质结构域具有丝氨酸磷酸化位点、KIEELE序列和谷氨酸脯氨酸重复序列3个部分，其中KIEELE序列对LAG3发挥抑制功能具有关键作用，已被证明是LAG3下调T细胞功能的必需成分[7-8]。但是，LAG3发挥作用的具体信号转导机制仍不清楚[6,9]。LAG3早期被发现表达于活化的T细胞（主要是CD4+T细胞、CD8+T细胞和部分γδT细胞）和自然杀伤（natural killer，NK）细胞，后来证实LAG3也在B细胞、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）上表达[7,10-11]。LAG3的表达及其与MHCⅡ类分子的亲和力在炎性条件下显著上调，部分炎性因子如白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-7和IL-12等可以提高活化T细胞上LAG3的表达水平[10]。并且，LAG3的结合能力通常与MHCⅡ类分子的表达水平相关[12]。

1.2 LAG 3的配体

MHCⅡ类分子是最早被发现的LAG3配体。LAG3以较高的亲和力与MHCⅡ类分子结合，二者相互作用可下调肿瘤浸润性CD4+T细胞的增殖并抑制细胞因子的分泌，且该过程中伴有LAG3的上调[10]。除了MHCⅡ类分子以外，肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的半乳糖凝集素-3（Galectin-3）和肝窦内皮细胞凝集素（liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin）也被证实是LAG3的配体[9]。Galectin-3是一种可溶性凝集素，通过LAG3途径抑制CD8+T细胞的功能并抑制pDC的增殖，从而抵抗机体的抗肿瘤免疫反应，可在多种细胞类型（包括肿瘤细胞）中广泛表达[4]。因此，Galectin-3与LAG3的相互作用可增强其对TME中肿瘤浸润性CD8+T细胞的免疫调节作用[13]。LSECtin在肝脏和肿瘤细胞中表达，LSECtin/LAG3通过抑制抗原特异性效应T细胞中γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌以减弱抗肿瘤免疫反应，采用抗LAG3抗体进行阻断后可逆转LSECtin介导的IFN-γ分泌减少[14]。Wang 等[15]研究发现，纤维蛋白原样蛋白1（fibrinogen like 1，FGL1）是独立于MHCⅡ类分子的主要的LAG3功能配体。FGL1能够抑制肿瘤抗原特异性T细胞活化，单克隆抗体对FGL1/LAG3的阻断可增强机体的抗肿瘤能力。此外，该研究还发现恶性肿瘤患者血浆中高水平的FGL1与预后不良以及对程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称 PD-1）/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）抑制剂治疗的耐药性相关，这对于肿瘤免疫治疗的发展意义重大。另有研究发现，病理性α-突触核蛋白原纤维也可以与LAG3结合而发挥生物学作用，病理性α-突触核蛋白原纤维在神经元之间的传递通过LAG3与神经元的结合来完成，由于错误折叠的α-突触核蛋白原纤维在细胞间传递可能是帕金森病的一种发生机制，LAG3阻断或许能够使帕金森病的治疗获得令人惊喜的效果[16]。总之，目前已发现LAG3具有多个配体，可能还有其他配体尚未被发现，有待于继续探索并确定是否为有效配体及其与LAG3相互作用的时间和机制，这对LAG3的后续研究至关重要。

2 LAG 3的免疫抑制作用

早期研究已经明确LAG3具有免疫抑制作用，能够负性调节T细胞的活化，LAG3缺乏或对LAG3进行阻断可促进T细胞的活化、增殖和细胞因子的产生[5]。如前所述，LAG3在CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg、NK细胞及pDC上均可表达。但LAG3与NK细胞间的作用机制尚不明确[9-12]。有研究表明，IL-12能够诱导NK细胞中LAG3的表达[17]。LAG3发挥免疫调节作用的机制如下：①通过负性调节作用直接抑制效应T细胞的活化、增殖及功能，并参与T细胞“耗竭”和维持T细胞稳态[5,18-19]；②增强免疫抑制细胞Treg的抑制活性[6,18]；③在肿瘤部位的LAG3介导pDC的激活，而后者可以引导免疫耐受[20-21]。

2.1 LAG 3影响免疫稳态

淋巴细胞尤其是T细胞的数量对免疫稳态的维持具有关键作用。T细胞的动态平衡受严格调控，产生的细胞池需要满足两个条件，既能对抗外来抗原又可防止自身发生过度免疫[18]。在外周，T细胞稳态至少受T细胞抗原受体（T lymphocyte antigen receptor，TCR）、γ链细胞因子信号转导及Treg的抑制活性3个方面调控[18]。LAG3在Treg上组成性表达并可促进其分化，这有助于后者发挥免疫抑制作用，而LAG3阻断可减弱Treg的功能[9,18]。FOXP3+Treg是维持免疫稳态的重要调节剂[22]。IL-27兼具促炎和抗炎功能，可以通过增强Treg的功能控制某些自身免疫病。研究显示，IL-27能够诱导Treg表达LAG3[22]。这些研究从另一方面说明了LAG3通过Treg影响机体的免疫系统。此外，CD4+T细胞上LAG3的表达与γ链细胞因子（如IL-2、IL-7、IL-12和 IFN-γ）有关[18]。因此，LAG3破坏了CD4+T细胞的稳态，并且肿瘤浸润的LAG3+Treg可产生大量的免疫抑制分子IL-10和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）[4]。

2.2 LAG 3与pDC的相互作用

pDC是可以产生Ⅰ型干扰素的树突状细胞（dendritic cell，DC）的独特子集，也可以诱导耐受性免疫应答。静息状态下pDC上的LAG3mRNA较T细胞增加约70倍，但LAG3在任何髓样或淋巴样DC子集上均不表达[5]。pDC富集到肿瘤部位通常与预后不良有关，因为肿瘤浸润性的pDC趋向于致耐受性而非免疫性[20]。有研究证实了肿瘤部位存在LAG3介导的pDC激活，并且在肿瘤进展过程中，MHCⅡ类分子/LAG3的相互作用和所导致的pDC激活可能会随着恶性肿瘤的进展而增加[21]。

2.3 LAG 3对 T细胞的调节

Maruhashi等[12]研究发现，LAG3并非直接与CD4竞争性地结合MHCⅡ类分子，而是通过构象依赖性选择性地识别稳定的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物（pMHCⅡ），进而抑制CD4+T细胞的增殖与活化，这种高度选择性有助于其维持自身免疫耐受。值得注意的是，肿瘤浸润性CD4+T细胞上LAG3的表达水平会随着肿瘤的进展而上调[10]。一项研究发现，LAG3调节CD4+T细胞的方式是调控后者的代谢水平，LAG3缺乏后通过提高线粒体生物发生（即在细胞中形成新线粒体的过程[23]）的水平来增强初始CD4+T细胞的代谢活动。LAG3阻断后可将部分野生型CD4+T细胞的增殖和代谢表型恢复至LAG3-/-CD4+T细胞的水平，这揭示了LAG3调控CD4+T细胞的另一途径[24]。

在慢性炎症环境中（如肿瘤或慢性感染性疾病），持续性的抗原暴露和T细胞活化会导致LAG3在T细胞上表达上调，并常与其他免疫抑制性受体如PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin protein-3，TIM-3）、含Ig及ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）等共表达，导致T细胞免疫功能异常[25]。并且，在慢性病毒性感染和恶性肿瘤中，包括LAG3在内的多个共抑制受体在“疲惫”的CD8+T细胞上均呈高表达[4,26]。“疲惫”的CD8+T细胞存在功能障碍，细胞因子产生减少[5]。尽管这些共抑制受体有利于肿瘤的发生、进展和逃逸，但是对于机体正常的免疫系统稳态是必不可少的。体外自身免疫模型中的研究验证了LAG3缺乏或功能缺陷会导致无法维持正常的免疫耐受[5]。并且同类型的研究发现，LAG3-/-PD-1-/-型小鼠死于致命的全身免疫，表明了LAG3和PD-1在维持免疫稳态和预防自身免疫病方面具有协同作用[5,27-28]。这也是ICB疗法不良反应的一个重要方面。在慢性感染性疾病模型中，LAG3的表达与感染的严重程度直接相关，并且其在病毒特异性CD8+T细胞和寄生虫特异性CD4+T细胞上均与PD-1共表达，LAG3/PD-1协同阻断可在一定程度上逆转T细胞的“耗竭”[23]，改善CD8+和CD4+T细胞的免疫功能[29-30]。

临床前研究显示，LAG3阻断增强了CD8+T细胞的功能，并引起较高水平的IFN-γ产生[18]。已有多项研究表明，LAG3在各种恶性肿瘤（如卵巢癌、肝细胞癌、肾癌等）的肿瘤浸润性CD8+T细胞中过表达[18-19]。Galectin-3和LSECtin主要与LAG3相互作用来调节CD8+T细胞的活化与功能[13-14]。研究发现，多种人类和小鼠肿瘤模型中肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上的LAG3与PD-1共表达[27,31-32]，二者具有协同作用，LAG3与PD-1协同阻断改善了CD4+和CD8+TIL的反应[23]，这表明抗LAG3抗体联合PD-1/程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）可以增强机体的抗肿瘤免疫反应，也为后续的LAG3抑制剂与其他ICI联合应用的临床试验奠定了基础[22,33-34]。虽然目前对于不同的抑制性受体介导的免疫调节作用的机制尚不完全清楚，但越来越多的证据表明，与单一ICB相比，双重阻断在体外和体内均可增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的功能[26]。总而言之，LAG3是T细胞“耗竭”的重要参与者，作为继PD-1/PD-L1/CTLA4之后的又一关键靶点，其对于恶性肿瘤的临床治疗具有重要意义。

3 LAG 3在恶性肿瘤免疫治疗中的临床研究

ICI在恶性肿瘤免疫治疗中取得了巨大的成就，尤以PD-1/PD-L1/CTLA4的抑制剂效果最为显著。然而随着ICI越来越广泛地应用于临床，其存在的问题和局限性也日益凸显，例如ICI的总体反应率较低、原发或获得性耐药以及ICI导致的免疫相关不良反应等。除了解决这些问题，许多研究者也开始寻求新的思路，将探索方向对准新兴的免疫治疗靶点LAG3，同时多种治疗方法组合的模式如ICI联合嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）、分子靶向治疗或双重ICB等也显现出一定的临床获益。

有研究显示，人血清中可溶性LAG3（soluble LAG3，sLAG3）的水平代表细胞介导的免疫反应的激活水平，IMP321是sLAG3二聚体的重组形式，是临床研发的一种APC激活剂，通过MHCⅡ类分子刺激APC以及被APC刺激的次级靶细胞（如记忆T细胞）可以诱导持续的免疫反应，这种方式不同于抗LAG3抗体对LAG3/MHCⅡ类分子相互作用的阻断[35]。IMP321已经在肾细胞癌、转移性乳腺癌和黑色素瘤中进行了初期临床试验，但仅在小部分患者中观察到有限的成效[8]。最近一项旨在评估紫杉醇+IMP321对比紫杉醇+安慰剂治疗转移性乳腺癌的研究AIPAC（NCT02614833）正在进行中[35]。此外还有多项将IMP321用于原位免疫（如肿瘤疫苗）的临床试验（如NCT01308294、NCT00365937、NCT00324623）以及将IMP321联合其他ICI治疗恶性肿瘤的临床试验（如NCT02676869、NCT03625323）均已启动。

Relatlimab（BMS-986016）是目前开展临床试验较多的抗LAG3单克隆抗体，在PD-1/PD-L1治疗后进展的黑色素瘤人群中表现出了良好的效果（NCT01968109）[36]。此外还有十余项Relatimab联合其他ICI的研究开始招募患者或正在进行中。LAG525是另一种人源化抗LAG3单克隆抗体。LAG525的第一项临床试验是研究LAG525+PDR001（Spartalizumab，抗PD-1单克隆抗体）治疗晚期恶性肿瘤的疗效（NCT02460224）。正在进行中的还有LAG525+PDR001用于晚期实体瘤和血液恶性肿瘤的Ⅱ期临床研究（NCT03365791）[37]。LAG3单克隆抗体MK-4280单独给药或联合派姆单抗（Pembrolizumab）针对晚期实体瘤的临床研究（MK-4280-001）预计共纳入340例患者，目前也正在招募（NCT02720068）[38]。其他的 LAG3抑制剂如 REGN3767[39]、TSR-033[40]和 Sym022[41]也已陆续开展相关临床试验。值得一提的是，目前已经研发出同时针对LAG3和PD-1两个靶点的双特异性免疫检查点阻断剂FS118和MGD013，以达到用一种治疗药物同时阻断两种抑制途径的目的[9]。这一类药物具有很大的临床应用潜力，期待能够产生较单靶点阻断更好的效果。

4 小结与展望

LAG3被认为是很有潜力的新一代免疫检查点之一。基于充分的临床前研究，关于LAG3的临床试验已经在多种类型的肿瘤中展开。但仍有诸多问题亟待解决：首先，LAG3的生物学特性复杂，其与配体结合后的下游信号转导通路仍不明确，这对于研究以LAG3为靶点的药物十分必要；其次，最近发现的LAG3配体是FGL1，猜测LAG3可能还会存在其他配体，未来是否能够发现对抗肿瘤作用更为有利的配体作为作用点？再次，机体的免疫系统存在高度的功能冗余，以确保在一个或多个共抑制受体途径缺陷的情况下仍能维持免疫稳态和正常的免疫耐受[6]，而不同的免疫检查点作用机制不同，它们之间是否存在特殊的相互作用模式、如何相互作用的，以及如何寻求最优组合治疗方案？众所周知，ICI的临床应答率有限，因此应寻求合适的预测性生物标志物以筛选合适的人群，更有利于实现肿瘤的精准治疗。已有研究分析LAG3的表达与治疗反应率的关系，相信不久的将来会有更多的研究针对此方向进行分析。总体而言，对LAG3的研究尚处于早期阶段，仍需继续深入研究，以期能够带来更多的临床获益。