含1,2,4,5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺类化合物的设计、合成及生物活性

董心睿，夏 喆，王桢学，边 强，李华斌

（南开大学化学学院,天津300071）

吡唑甲酰胺类化合物含有吡唑和酰胺2种高活性结构基团，因而具有广泛的生物活性.自20世纪40年代以来，在农药开发领域不断有文献报道具有生物活性的吡唑甲酰胺类衍生物，其中报道最多的是杀虫剂［1～8］和杀菌剂［9，10］，此外，具有除草活性、杀螨活性及其它生物活性的吡唑甲酰胺类化合物也相继被报道［11～13］，如吡螨胺、唑虫酰胺和呋吡菌胺等农药新品种.吡唑甲酰胺类农药因其作用机理独特、安全高效、无互抗性、有效用量小及吡唑环上取代基多方位变化等优点而备受关注.吡唑甲酰胺类化合物由于酰胺基在吡唑环上的取代位点不同而产生不同的生物活性.其中，当酰胺基在吡唑环的4-位时，多数表现出较好的杀菌活性［14～17］，部分化合物表现出较好的除草活性、杀虫活性和杀螨活性等［18～21］.该类化合物具有代表性的品种为日本住友化学公司开发的呋吡菌胺（Furametpyr）［22］.呋吡菌胺于1997年上市，对担子菌纲的大多数病菌尤其是水稻纹枯病具有优异防治效果，大田防治的剂量为有效成分450～600 g/hm2.其作用机制是通过抑制真菌线粒体中琥珀酸的氧化，从而避免立枯丝核菌菌丝体分离，而对真菌线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化无影响.2003年，日本三井化学株式会社在英国植保会议上介绍了新的酰胺类杀菌剂吡噻菌胺（Penthiopyrad）［23］.该药剂有效成分剂量通常为100～200 g/hm2，其杀菌谱广，对锈病和菌核病显示出优异活性，对灰霉病、白粉病和苹果黑星病也显示出较好的抑制活性.

丙炔氟草胺（Flumioxazin）［24］是日本住友工业株式会社创制并开发的N-苯基邻氨甲酰亚胺类除草剂，于播种后出苗前按有效成分60～90 g/hm2施用，对花生安全，对马齿苋、反枝苋和藜等花生田等常见阔叶杂草有显著防治效果.唑草酮（Carfentrazone-ethyl）［25］是1990年由美国富美实（FMC）公司开发的三唑啉酮类除草剂，于苗后茎叶处理，使用剂量通常为9～35 g/hm2，主要用于防除阔叶杂草和莎草，适用于小麦、大麦、水稻和玉米等作物田.上述2个除草剂品种都属于原卟啉原氧化酶（PPO）抑制剂，即通过抑制叶绿素生物合成过程中原卟啉原氧化酶而引起细胞膜破坏，使叶片迅速干枯、死亡.该类除草剂具有微量高效、生态环境友好且不易产生抗性等特点［26～29］，具有很高的研究价值和应用前景.目前，已经有30多种PPO抑制剂被研发［30］.研究结果表明，该类除草剂的结构共性为含有1，2，4，5-四取代苯基.

为了发现结构新颖、高效低毒且作用机制独特的新型农药，本文通过活性亚结构拼接的方式，保持呋吡菌胺和吡噻菌胺的吡唑-4-甲酰胺结构，引入1，2，4，5-四取代苯基，设计并合成了一系列含1，2，4，5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺类化合物，目标化合物的设计思路如图1所示.对所有目标化合物进行了杀菌活性筛选，并对其构效关系进行了初步分析.

Fig.1 Design strategy of 1H-pyrazole-4-carboxamides containing 1,2,4,5-tetra-substituted phenyl

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

柱层析用H型硅胶（青岛海洋化工厂）；所用试剂均为国产分析纯.Bruker Avance-300和400 MHz型核磁共振波谱（NMR）仪，CDCl3为溶剂，TMS为内标，瑞士布鲁克公司；X-4型数字显示显微熔点测定仪，北京泰克仪器有限公司；Varian 7.0 T型傅里叶变换高分辨质谱（HRMS）仪，美国瓦里安公司.

1.2 实验过程

1.2.1 化合物1～3的合成参照文献［31，32］方法合成化合物1，2和3，合成路线如Scheme 1所示．

Scheme 1 Synthetic routes of compounds 5 and 5′

1.2.2 1，2，4，5-四取代苯基吡唑-4-甲酰胺（5a～5j和5′a～5′m）的合成以1-甲基-5-氨基-N-（2-氟-4-氯-5-甲氧羰基苯基）-1H-吡唑-4-甲酰胺（5a）的合成为例.在50 mL的圆底烧瓶中加入0.71 g（5 mmol）1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酸（3a），在冰盐浴冷却下滴加10 mL二氯亚砜，滴加完毕，自然升至室温，搅拌3 h，减压抽掉二氯亚砜，得0.98 g黄色固体1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯（4a），不经纯化直接用于下一步反应.在50 mL圆底烧瓶中，加入0.45 g（2.2 mmol）2-氯-4-氟-5-氨基苯甲酸甲酯、10 mL二氯甲烷和1.2 mL吡啶，用冰盐浴冷却至0℃以下，加入0.39 g（2 mmol）化合物4a，自然升至室温，通过薄层色谱（TLC）监测反应；待反应完毕，减压脱去溶剂，残留液用30 mL盐酸（1 mol/L）洗涤，过滤，固体再用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，过滤，干燥得到0.38 g灰白色固体1-甲基-5-氨基-N-（4-氯苯基）-1H-吡唑-4-甲酰胺（5a）.采用相同的方法合成5b～5j和5′a～5′m.

目标化合物5和5′的理化数据及高分辨质谱数据列于表1，核磁共振氢谱（1H NMR）数据列于表2.

Table 1 Appearance,melting points,yields and HRMS data of compounds 5a—5j and 5′a—5′m*

Table 2 1H NMR data of compounds 5a—5j and 5′a—5′m*

Continued

1.2.3 目标化合物的生物活性测试将一定量的目标化合物溶解在适量二甲基甲酰胺（DMF）中，然后用乳化水稀释至50 mg/L，采用离体平皿法［9］测试其杀菌活性.供试病原菌包括黄瓜枯萎病菌（C.cucumerinum）、花生褐斑病菌（C.rachidicola）、苹果轮纹病菌（P.piricola）、蕃茄早疫病菌（A.solani）、小麦赤霉病菌（G.zeae）、马铃薯晚疫病菌（P.infestans）、油菜菌核病菌（S.sclerotiorum）、黄瓜灰霉病菌（B.cinerea）、水稻纹枯病菌（R.solani）和辣椒疫霉病菌（P.capsica）.

2 结果与讨论

2.1 合成及结构表征

以2-氰基-3-乙氧基丙烯酸乙酯（1）为原料，与取代肼反应，关成吡唑环，得到化合物2；在碱性条件下水解，酸化后得到化合物3；然后经过酰氯化反应得到酰氯4，不进行分离，直接用于下一步反应；与四取代苯胺缩合，得到目标化合物5和5′.其中，中间体1-取代基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯（4）的制备非常关键.因为化合物4的双官能团（氨基和酰氯）可能会发生缩合反应，产生自聚.由于取代苯胺氨基的活性比吡唑环上的氨基高，可以通过调节反应条件而控制自聚的发生.实验结果表明，在高温或原料滴加速度过快时，会产生带有荧光点的副产物，但通过普通的1H NMR不足以确定其结构.因此，在实验过程中，需要注意以下2个条件：（1）控制反应温度，需要用冰盐浴冷却至0℃以下；（2）加入1-甲基-5-氨基-1H-吡唑-4-甲酰氯的速度要慢，因为该反应会放热.

目标化合物的1H NMR谱解析以化合物5c为例.δ7.54处为吡唑环上氢的吸收峰，呈单峰；δ7.36处为酰胺N上氢的吸收峰，呈宽峰；δ8.15和7.15处分别为苯环上2个氢的吸收峰，被氟原子裂分，呈双重峰，其中耦合常数大的（J=10.5 Hz）处于氟原子邻位，耦合常数小的（J=7.4 Hz）处于氟原子间位；δ5.23处为吡唑环上的氨基氢的吸收峰，呈宽峰；δ4.60～4.52处为异丙基的次甲基吸收峰，呈多重峰；δ3.66处为吡唑环上甲基氢的吸收峰，呈单峰；δ1.41和1.37处分别为异丙基的2个甲基的吸收峰，呈单峰.

2.2 生物活性及初步构效关系分析

对化合物5a～5′m进行了相对抑菌率测定，计算方法见下式：

相对抑菌率计算结果列于表3.化合物5和5′在50μg/mL浓度下，对10种供试病原菌均表现出一定的抑制活性.其中，对于苹果纹轮病菌，化合物5c的抑菌率达到95.5%，化合物5h和5′k的抑菌率均超过60%，化合物5d的抑菌率超过50%；对于水稻纹枯病菌，化合物5c，5i，5′a和5′j的抑菌率均超过60%；对于油菜菌核病菌，化合物5j和5′c的抑菌率均超过50%；对于黄瓜灰霉病菌，化合物5h，5′a和5′m的抑菌率最低可达50%.化合物5c表现出较广的杀菌谱，对于花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌、蕃茄早疫病菌、马铃薯晚疫病菌和水稻纹枯病菌的抑菌率均超过50%；化合物5h对苹果轮纹病菌、黄瓜灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌率均超过50%.

Table 3 Fungicidal activities of target compounds at 50μg/mL

初步构效关系分析发现，吡唑环N取代基为甲基或叔丁基时，化合物表现出较好的活性；整体来看，含并环结构的化合物5′杀菌活性低于含单个苯环的化合物5，如高活性化合物5c和5h均为只含单个苯环的化合物；苯环取代基R2为低于4个碳的脂肪链时，化合物杀菌活性更高，如化合物5c和5d；而当苯环取代基R2为不少于4个碳的脂肪链或酯基时，化合物活性大幅下降，如化合物5e，5f，5g，5a和5b的杀菌活性很低.

3 结 论

利用活性亚结构拼接的方法，设计合成了一系列含1，2，4，5-四取代苯基的吡唑-4-甲酰胺类化合物.生物活性测试结果表明，部分化合物对苹果纹轮病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌表现出较好的杀菌活性.尤其是化合物5c表现出较广的杀菌谱，当其浓度为50μg/mL时对苹果纹轮病菌的抑菌率高达95.5%.初步构效关系分析发现，吡唑环N取代基为甲基或叔丁基时，化合物表现出较好的活性；含并环结构的化合物5′的杀菌活性低于含单个苯环的化合物5；苯环取代基R2为低于4个碳的脂肪链时，化合物杀菌活性更高，这为进一步结构优化提供了依据.尤其是化合物5c，可作为先导化合物进行后续优化研究.