BDT、BDTO分子结构修饰后高发光性能纳米材料的筛选及其在血清PCT检测中的应用

张海燕，张赛，邝振展，胡蓉,刘仲明 中国人民解放军南部战区总医院，广州5000；深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司;华南理工大学

降钙素原(PCT)是降钙素的前肽物质，广泛应用于感染性疾病的诊断及鉴别诊断，近年来PCT已经成为全身性炎症反应、败血症、脓毒血症等疾病的预警生物指标之一[1]。目前，PCT的检测方法主要有免疫荧光法、胶体金免疫层析法、凝胶层析法及高效液相色谱分析法等[2]，但现有的商品化荧光材料在高浓度或聚集状态下通常发光会减弱甚至不发光，即聚集导致的荧光淬灭(ACQ)，从而严重影响了检测灵敏度[3]。具有聚集诱导发光(AIE)性能的荧光材料被证实在聚集态及固态下均具有较高的发光性能，可有效减少ACQ现象，广泛应用于检测、成像等诸多领域[4]。苯并[1,2-b:4,5-b′]二噻吩(BDT)是一种重要的含硫杂环，具有较大的共轭平面等特点[5,6]，能赋予体系优异的光学性能。此外，BDT是一种典型的给电子基团，便于构筑给-受体(D-A)型结构，调控发光性能。2019年2～8月，本研究制备了含BDT及对BDT氧化后的苯并[1,2-b：4,5-b′]-二噻吩1,1,5,5-四氧化物(BDTO)的系列衍生物，筛选BDT和BDTO经三苯胺(TPA)、3位连接咔唑(PcZ)、9位连接咔唑(CzP)及叔丁基(TCzP)分子结构修饰后具有高发光性能的纳米材料，并将其应用于血清PCT的磁微球免疫荧光分析检测。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 血清样本：检测确认后的不同浓度血清PCT样品由中国人民解放军南部战区总医院检验科提供。主要试剂：300 μm粒径磁珠标记的抗PCT捕获抗体(0.1 mg/mL)、荧光微球FM02标记的抗PCT检测抗体(1 mg/mL)均购自深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，清洗液(含0.2% Tween的PBS溶液)、酶联免疫荧光试剂均购自梅里埃诊断产品有限公司。主要仪器：F97荧光分光光度计购自上海棱光技术有限公司，ThermoCell MiXing Block MB-102恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司，八通道磁分离架购自德国Merck Millipore公司。

1.2 BDT、BDTO的分子结构修饰 参照Zhen等[7]的方法，对BDT、BDTO进行TPA、PcZ、CzP及TCzP分子结构修饰，制备TPA-BDT、TPA-BDTO、PcZ-BDT、PcZ-BDTO、CzP-BDT、CzP-BDTO、TCzP-BDT、TCzP-BDTO等8种BDT、BDTO化合物，其结构式见图1。以CzP-BDT及CzP-BDTO为例，CzP-BDT的制备方法：在125 mL的两口瓶中加入604 mg(1 mmol)双溴苯并二噻吩、1 150 mg(4 mmol)咔唑硼酸、58 mg四(三苯基膦)钯(0.05 mmol)和553 mg碳酸钾(4 mmol)，抽换气3次之后加入甲苯∶乙醇∶水(体积比为8∶1∶1)150 mL，加热反应12 h后，冷却至室温；倒入蒸馏水中，二氯甲烷萃取3次，合并萃取得到的有机层溶液，饱和碳酸氢钠洗2次、水洗3次；无水硫酸镁干燥，过滤后将有机溶剂通过旋蒸除去；采用柱层析法进行分离提纯，最后得到黄色固体产物CzP-BDT。CzP-BDTO的制备方法：在125 mL的两口瓶中加入670 mg(1 mmol)双溴苯并氧化二噻吩、1 150 mg(4 mmol)咔唑硼酸、58 mg四(三苯基膦)钯(0.05 mmol)和553 mg碳酸钾(4 mmol)，其余步骤同CzP-BDT的制备，最后得到橙红色固体产物CzP-BDTO。采用核磁(1H-NMR和13C-NMR)以及高分辨质谱对8种BDT、BDTO化合物进行结构表征分析，结果显示其表征数据与Zhen等[7]的研究结果一致，证实所制备的化合物与预期一致。

图1 8种BDT、BDTO化合物的结构式

1.3 高发光性能纳米材料的筛选

1.3.1 发光性能相关指标检测 将1.2得到的8种化合物溶解在四氢呋喃(THF)中，分别在紫外-可见分光光度计及荧光光谱仪上分析其紫外吸收光谱以及荧光发射光谱，以此判断其最大吸收波长(λabs)、最大发射波长(λem)及Stokes位移。Stokes位移越大表示其发射的荧光越不容易被自吸收，即发光效率越高。将1.2得到的相同浓度的8种化合物(10 μmol/L)分别溶解在THF溶液(10 μmol/L，溶液态)和90%去离子水(THF∶H2O=1∶9，10 μmol/L，聚集态)中，用各自的λabs作为激发光源，测试其分别在溶液态及聚集态的绝对量子产率。绝对量子产率越高表示在相同激发条件下材料的发光性能越高，信噪比越高，即检测的灵敏度越高。

1.3.2 在水中的聚集态行为观察 利用动态光散射(DLS)法观察8种纳米材料在水中的分散行为。以CzP-BDT为例，将CzP-BDT分散在水中(10 μmol/L)，总体积不超过1 mL，静置2 min排除水溶液中的气泡，在DLS仪器上检测其粒径分布，平行检测3次得到最终的实验结果。以粒径分布判断其在水中的分散性，在水中分散较好的疏水性分子越容易制备得到纳米粒子，且粒径分布越好、稳定性越高。其他化合物的粒径表征均与CzP-BDT一致。

1.4 CzP-BDT纳米粒子的包装及标记 ①CzP-BDT纳米粒子的包装：采用改进的共沉淀技术[7]。基于DSPE-PEG-Mal聚合物作为包覆基质，通过注入含有CzP-BDT和DSPE-PEG-Mal的THF溶液，制备CzP-BDT纳米粒子，并分散于去离子水中。经过连续超声处理形成CzP-BDT纳米粒子，DLS持续检测，结果显示其具有高稳定性、良好的水分散性，此外采用的包覆基质末端为羧基，使其表面易于功能化。将制备得到的CzP-BDT纳米粒子行DLS检测,结果显示CzP-BDT纳米粒子的水合粒径为347 nm。②CzP-BDT纳米粒子的标记：采用酰胺缩合一步法对CzP-BDT纳米粒子标记抗PCT检测抗体，在纳米粒子水溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化纳米粒子表面的羧基，搅拌30 min后，加入抗体，继续反应5 h。

1.5 血清PCT检测 ①采用荧光微球FM02的磁微球免疫荧光分析法(简称FM02法)。用生理盐水将浓度为75 ng/mL的血清PCT样品分别稀释为45、30 ng/mL。取浓度分别为45、30、<0.05 ng/mL的血清PCT样品和生理盐水各100 μL，分别与磁珠标记的抗PCT捕获抗体(0.1 mg/mL)和荧光微球FM02标记的抗PCT检测抗体(0.1 mg/mL)各100 μL振荡混匀；37 ℃条件下孵育20 min，置于磁分离架静置2 min，清洗液清洗后复溶，在470 nm激发波长下检测其荧光发射光谱。②采用CzP-BDT的磁微球免疫荧光分析法(简称CzP-BDT法)。用生理盐水将浓度为75 ng/mL的血清PCT样品分别稀释为45、30 ng/mL。取浓度分别为45、30、<0.05 ng/mL的血清PCT样品和生理盐水各100 μL，与磁珠标记的抗PCT捕获抗体(0.1 mg/mL)和CzP-BDT纳米粒子标记的抗PCT检测抗体(0.1 mg/mL)各100 μL振荡混匀；37 ℃条件下孵育20 min，置于磁分离架静置2 min，清洗液清洗后复溶，在364 nm激发波长下检测其荧光发射光谱。记录两种方法检测时在最大发射峰处的荧光强度。

2 结果

2.1 8种BDT、BDTO化合物的发光性能相关指标检测结果 8种化合物在聚集态均有较强的荧光发射，其λem均在可见光范围内，BDT化合物的λem为453～475 nm、BDTO化合物的λem为573～630 nm；在同种BDT或BDTO化合物中，PcZ、CzP、TCzP修饰后化合物的λabs、λem差异较小，而TPA修饰后化合物较前面三者修饰后化合物的λabs、λem均有一定程度红移，即向长波长方向移动；BDTO化合物的λabs、λem相较于BDT化合物均发生红移。BDTO化合物的Stokes位移普遍大于BDT化合物，而CzP修饰化合物的Stokes位移大于TPA、TCzP和TCzP修饰化合物。CzP-BDT、TCzP-BDT和TCzP-BDTO聚集态的绝对量子产率高于溶液态，BDTO化合物在溶液态、聚集态中的绝对量子产率普遍高于BDT化合物。8种化合物中，CzP-BDT无论在溶液态还是聚集态均具有较高的发光性能。见表1。

表1 8种BDT、BDTO化合物的发光性能相关指标检测结果

2.2 8种BDT、BDTO化合物在水中的粒径分布情况比较 除TCzP-BDT外，其他3种BDT化合物在水中的粒径分布相差不大；4种BDTO化合物在水中的粒径分布只有细微差异，并且BDTO化合物在水中的分散性较BDT化合物均有一定程度的增加。CzP-BDT在水中虽然分布不均，但在BDT化合物中，CzP-BDT在低于100 nm部分有较多的分布，综合其较高的发光性能，选择CzP-BDT作为进行后续实验的纳米材料。8种BDT、BDTO化合物在水中的粒径分布情况见图2。

图2 8种BDT、BDTO化合物在水中的粒径分布情况

2.3 两种方法检测不同浓度血清PCT的荧光光谱比较 在470 nm激发光波长下，FM02法检测的发射光谱为500～650 nm，在525 nm处测得最大荧光强度；其中检测45 ng/mL的血清PCT样品时在525 nm处荧光强度为415.5，检测30 ng/mL和<0.05 ng/mL的血清PCT样品以及生理盐水时在525 nm处荧光强度分别为197.5、197.5、146.8。在340 nm激发光波长下，CzP-BDT法检测的发射光谱为500～650 nm，在525 nm处测得最大荧光强度；其中检测45 ng/mL的血清PCT样品时在525 nm处荧光强度为1 064.0，检测30 ng/mL和<0.05 ng/mL的血清PCT样品以及生理盐水时在525 nm处荧光强度分别为766.2、664.0、456.9。两种方法均能检出45 ng/mL的血清PCT样品，但对于30 ng/mL、<0.05 ng/mL的血清PCT样品，只有采用CzP-BDT纳米粒子进行免疫荧光检测能实现有效鉴别并与生理盐水进行区分。两种方法检测不同浓度血清PCT的荧光光谱见图3。

3 讨论

3.1 高发光性能纳米材料的发光性能相关指标

3.1.1 λemλem与给电子能力相关。本研究结果显示，8种化合物在聚集态都有较强的荧光发射，其λem均在可见光范围内；同种BDT或BDTO化合物中，PcZ、CzP、TCzP修饰后化合物的λabs、λem差异较小，而TPA修饰后化合物较前面三者修饰后化合物的λabs、λem均有一定程度红移；说明TPA较PcZ、CzP、TCzP的给电子能力更强，其化合物的D-A效果更明显。此外，BDTO化合物的λabs、λem相较于BDT化合物均发生红移，说明将噻吩氧化以后能够使BDTO化合物形成D-A型结构，提高其吸电子能力。由此可见，同种类型取代基对化合物的发光性能影响不大，其发光性能主要取决于骨架结构。

3.1.2 Stokes位移 Stokes位移大小取决于取代基给电子能力，取代基给电子能力越弱，Stokes位移就越大。由于本研究所选用的发光材料激发态构型相较于基态变化较大，导致其激发态能量耗散而具有较大的Stokes位移，较大的Stokes位移可以使化合物的发射光受激发光影响小，防止自身ACQ，能量损失少，能有效提高检测时的信噪比[8]。本研究结果显示，这8种化合物均具有较大的Stokes位移(68～127 nm)，同时BDTO化合物的Stokes位移大于BDT化合物，而CzP修饰化合物的Stokes位移大于TPA、TCzP、TCzP修饰化合物。

注：A为FM02法；B为CzP-BDT法。

3.1.3 发光效率 本研究结果显示，BDTO化合物的发光效率普遍高于BDT化合物，提示噻吩环的氧化能够有效提高化合物在溶液态及聚集态的发光效率。分析原因，氧化噻吩中的硫元素(S)被氧化以后，S上面的孤对电子会消失，降低单线态到三线态之间的系间窜跃，从而提高材料的量子产率；此外，氧化噻吩会有效提高π-π之间的距离，降低分子之间的相互作用，进一步提高发光效率[9]。本研究中，相对于其他7种化合物，TCzP-BDTO聚集态的发光效率最高，推测是由于叔丁基的引入会进一步降低分子间相互作用力，降低ACQ，从而提高固态发光量子效率。此外，CzP-BDT、TCzP-BDT和TCzP-BDTO聚集态的绝对量子产率高于溶液态，是因为随着聚集体的形成，其分子内运动受限，从而有效抑制激发态能量以非辐射的形式耗散，提高了聚集态及固态发光效率，表现出明显的AIE性能[10]。

3.1.4 在水中的聚集态行为 本研究结果显示，除TCzP-BDT外，其他3种BDT化合物在水中的粒径分布相差不大，说明TCzP的引入会大大增加化合物的疏水性，从而导致粒径增加。本研究BDT化合物具有较大且规整的平面结构，能够增加体系的电子离域能力，赋予体系良好的光学性能。推测是因为噻吩环的氧化引入了氧原子，有效增加了BDTO化合物与水的相互作用，从而提高了BDTO化合物在水溶液中的分散性和溶解性[11]。这为制备在水环境中具有良好分散性的发光材料提供了行之有效的策略。BDTO化合物能够提高分子内吸电子能力，形成D-A型结构，导致最高占据轨道(HOMO)与最低空轨道(LUMO)分离，使其吸收及发射均向长波移动；并且氧化噻吩会进一步提高化合物在水溶液及生理环境下的分散性，且这类化合物在聚集态下具有较高的发光效率，使得该类材料在生物大分子检测方面具有非常好的前景。

针对上述8种化合物的光物理性能分析结果， CzP-BDT在水中虽然分布不均，但其在低于100 nm部分有较多的分布；综合其发光性能，CzP-BDT是一种典型的AIE材料，拥有较大的Stokes位移及良好的光稳定性，可用于制备稳定性好、粒径小的纳米材料用于生物检测。因此，本研究选择CzP-BDT作为代表，用于研究具有良好发光性能的AIE材料在生物大分子检测中的应用。

3.2 血清PCT的免疫荧光检测 荧光微球在生物医学领域有着重要的应用价值，目前几乎所有高性能、高附加值的荧光微球材料都被国外垄断，我国荧光微球技术的发展处于一个滞后阶段，开发具有自主知识产权且产业化的高性能荧光微球已迫在眉睫。AIE材料是一种由中国科学家原创的新型发光材料，具有固态发光效率高、光稳定性强和Stokes位移大等光学特性，将其应用于荧光微球制备的研究，有望获得性能优异的功能性纳米荧光材料[12]。

本研究结果显示，两种荧光材料的发射光谱非常相似，而CzP-BDT纳米粒子的激发光波长比FM02荧光微球小，表明CzP-BDT纳米粒子具有更大的Stokes位移。此外，相同浓度下荧光光谱分析显示，相同条件下CzP-BDT纳米粒子的荧光强度高于FM02，因此CzP-BDT纳米粒子具有更高的量子效率，能有效提高检测的信噪比和灵敏度。本研究结果显示，相比FM02荧光微球，CzP-BDT纳米粒子最高峰的荧光强度更高，说明CzP-BDT纳米粒子的检测分辨率更高；两种方法均能检出45 ng/mL的血清PCT，但对于30 ng/mL、<0.05 ng/mL的血清PCT，只有采用CzP-BDT纳米粒子的荧光检测方法能实现有效鉴别并与生理盐水区分，说明CzP-BDT纳米粒子具有更低的检测限及更高的灵敏度。

综上所述，本研究对BDT、BDTO分子结构修饰后筛选出高发光性能的CzP-BDT纳米粒子，其应用于血清PCT免疫荧光检测的灵敏度高于FM02荧光微球，有望应用于临床生物分子的荧光检测，为发展具有我国自主知识产权的新一代发光材料及发光检测技术打下基础。随着未来对纳米粒子合成技术的改进和载体与荧光物质作用机理的深入研究，该类新型功能性荧光微球在生物医学领域可以得到进一步发展与应用。