miR-122靶向调控CREB1对膀胱癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其分子机制

王艺璇，郭立华 吉林大学中日联谊医院，长春130033

膀胱癌是常见的恶性肿瘤，其病死率和发病率在我国所有泌尿系统肿瘤中均排名第一[1, 2]，其复发率高、患者预后较差[3]。微小RNA122(miR-122)是与肿瘤密切相关的miRNA之一，在不同肿瘤中发挥的作用不同，既是肿瘤促癌因子又是抑癌因子[4, 5]。前期研究显示，miR-122在膀胱癌组织及细胞中均表达下调，其过表达可抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭、体外集落形成能力和体内血管生成能力[6]。转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)可通过磷酸化和去磷酸化来调节基因转录[7]，其在膀胱癌中表达上调，是膀胱癌患者预后不良的分子标志物[8]。研究显示，miR-122可通过靶向抑制CREB1而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力[9]，CREB1是否作为miR-122的靶基因而参与膀胱癌细胞的增殖和侵袭及其相关的下游通路目前均尚不明了。为此，我们于2019年1月～2020年3月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：膀胱癌J82细胞购自美国ATCC细胞库。主要试剂：RPMI1640培养基和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司，miRNA提取试剂盒购自上海玉博生物试剂有限公司，ULtraRT 一步法RT-PCR试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，双荧光素酶基因报告试剂盒和蛋白浓度检测试剂盒均购自中国上海碧云天生物试剂有限公司，MTS试剂购自美国Biovision公司，CREB1、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)均购自于美国Proteintech公司，ECL化学发光试剂盒购自于美国Thermo公司。引物：miR-122、CREB1、内参U6和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成。质粒：miR-122模拟物(miR-122 mimic)、CREB1过表达质粒、对照质粒、CREB1野生型质粒(CREB1-wt)和CREB1突变型质粒(CREB1-mut)均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2 miR-122与CREB1的靶向调控关系分析 采用双荧光素酶报告实验。TargetScan7.1软件(http://www.targetscan.org/)预测程序显示，miR-122与CREB1启动子区存在连续的结合位点，见图1。将J82细胞以3×103/孔接种到96孔板中，接种24 h后分为四部分，采用LipofectamineTM2000分别进行CREB1-wt、CREB1-mut与miR-122 mimic、对照质粒的共转染。转染48 h，采用双荧光素酶基因报告试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

图1 TargetScan7.1软件预测程序显示miR-122与CREB1之间存在连续的结合位点

1.3 细胞培养及分组转染 将J82细胞置于含有10% FBS的RPMI1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞生长状态较好时，胰酶消化收集细胞。将J82细胞分为三组，共转染组采用LipofectamineTM2000转染miR-122 mimic及CREB1过表达质粒，miR-122 mimic组转染miR-122 mimic，对照组转染对照质粒，转染48 h。

1.4 转染效果检测 采用实时荧光定量PCR法。收集各组细胞，采用miRNA提取试剂盒获得细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度。采用ULtraRT一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进一步扩增。miR-122上游引物5′-TATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′、下游引物5′-GCCCGTGGAGTGTGACAATGGT-3′，内参U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。CREB1上游引物5′-CTTTTCTCCGGAACACAGATTTC-3′、下游引物5′-GATTTGCCAAGTGGGAGGGA-3′，内参GAPDH上游引物5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′、下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。PCR反应体系：2×ULtraRT一步缓冲液12.5 μL、RNA 1 μL、上下游引物各1 μL、ULtraRT一步酶混合液0.5 μL，用无RNA酶的双蒸水补足25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个变性退火延伸循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-122、CREB1 mRNA相对表达量。

1.5 细胞增殖能力观察 ①MTS法：胰酶消化收集1.3中的各组细胞，以2×103/孔接种至96孔板中，每组设置6个复孔。培养48 h，加入20 μL MTS试剂与细胞共同孵育1 h。采用全波长扫描仪检测各孔450 nm波长处的光密度(OD)值，OD值越高表示细胞增殖能力越强。②平板克隆实验：胰酶消化收集1.3中的各组细胞，以2×102/孔接种至6孔板中，混匀后在细胞培养箱中培养，及时更换培养基。培养2周左右肉眼可见细胞克隆团形成时终止培养，甲醇固定、吉姆萨染色后计数克隆形成数。克隆形成数越多,表示细胞增殖能力越强。

1.6 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。胰酶消化收集1.3中的各组细胞，采用无血清培养基洗涤细胞，去除FBS和胰酶。将1×104个细胞重悬至100 μL无血清培养基中，混匀后加至Transwell小室的上室中，将500 μL含10% FBS的培养基加至Transwell小室的下室中。放置细胞培养箱中培养10 h，下室可见由上室穿过膜进入的细胞时终止培养。甲醇固定、吉姆萨染色后计数穿膜细胞数，细胞穿膜数越多表示细胞侵袭能力越强。

1.7 细胞CREB1及Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting法。各组转染48 h收集细胞，加入蛋白裂解液进行裂解。离心去除细胞碎片，获得细胞总蛋白。细胞总蛋白与上样缓冲液混匀后，经沸水煮沸变性。变性的蛋白上样进行凝胶电泳，并采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜置于8%牛奶中，室温孵育1 h。加入CREB1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、内参蛋白GAPDH一抗(稀释比例均为1∶500)，4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育2 h。TBST冲洗3次，采用ECL显示蛋白条带;Image J软件分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 双荧光素酶基因报告实验结果 共转染对照质粒+CREB1-mut或miR-122 mimic+CREB1-mut的J82细胞荧光素酶活性分别为1.00±0.10、0.92±0.13(P>0.05)，共转染对照质粒+CREB1-wt或miR-122 mimic+CREB1-wt的J82细胞荧光素酶活性分别为1.00±0.06、0.57±0.09(P<0.01)。

2.2 各组细胞miR-122、CREB1 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组细胞miR-122、CREB1 mRNA表达比较

2.3 各组细胞增殖、侵袭能力比较 见表2。

表2 各组细胞增殖OD值、克隆形成数、穿膜细胞数比较

2.4 各组细胞CREB1及Akt/mTOR信号通路蛋白表达比较 见表3。

表3 各组细胞CREB1及Akt/mTOR信号通路蛋白表达比较

3 讨论

膀胱癌是最常见的恶性泌尿生殖系统肿瘤之一，是尿路上皮演变而来的尿路上皮癌[1]。根治性膀胱切除术和全身化疗是治疗膀胱癌的主要方法，但其总体治疗效果有限，患者的5年生存率较低，高复发率和远处转移是导致患者预后较差的重要原因[3]。阐明膀胱癌发展的分子机制具有重要的临床意义，有助于探索膀胱癌新的治疗靶点和开发更有效的靶向药物。

miRNA是一类保守的内源性非编码RNA分子，长度为18～25个核苷酸，可通过转录后诱导降解或抑制靶信使RNA(mRNA)的翻译来调控靶基因，并参与调节如细胞发育、分化和运动等各种细胞功能。超过50%的miRNA位于与肿瘤相关的基因组区域，在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。近年来，miRNA作为抗癌药物的靶点被广泛研究[10]。尽管膀胱癌组织中已经鉴定出许多差异表达miRNA，但尚未开发出有效的临床药物。miR-122是在脊椎动物中表达高度保守的肝脏特异性miRNA，在肝细胞肝癌中是一种新型的肿瘤抑制因子[4]。miR-122在卵巢癌和胃癌等肿瘤中发挥抑癌作用，可抑制肿瘤细胞的恶性进展[11, 12]；但是，在结直肠癌和肾癌等肿瘤中miR-122发挥促癌作用，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等生物学行为[5,13]。以上提示miR-122与肿瘤的发生发展密切相关，但是发挥的作用并不一致。Wang等[6]报道，miR-122在膀胱癌组织和细胞系中的表达均降低，过表达miR-122在体内和体外均可抑制膀胱癌细胞HT1376的恶性生物学行为。本研究结果显示，转染miR-122 mimic后，J82细胞的增殖和侵袭能力降低，说明miR-122 在膀胱癌中可发挥抑癌作用。

miRNA通常通过与3′-UTR的互补碱基配对来抑制mRNA翻译，并降低mRNA稳定性，从而调节基因表达。研究报道，miRNA可调节多种癌基因或抑癌基因，从而参与肿瘤的发生发展[10]。在卵巢癌中miR-122通过靶向脯氨酰-4-羟化酶亚基α-1(P4HA1)基因发挥抑癌作用[11]，在膀胱癌中miR-122通过靶向促癌基因血管内皮生长因子C(VEGFC)的表达而抑制细胞增殖和侵袭[6]。每一个miRNA可以调控多个靶基因，CREB1是原癌基因转录因子，可促进其靶基因表达，参与代谢和DNA修复[7]。研究报道，CREB1表达升高可促进乳腺癌和结直肠癌等多种肿瘤的进展，为肿瘤促癌基因[14, 15]。Rao等[9]报道,在胃癌中CREB1可作为miR-122的直接作用靶点，参与miR-122对于肿瘤细胞增殖和侵袭能力的抑制作用。本研究采用TargetScan7.1软件预测miR-122与CREB1启动子区具有连续的结合位点，并且双荧光素酶基因报告实验结果显示，在J82细胞中miR-122可靶向负调控CREB1。本研究进一步实验结果显示，CREB1过表达可以减弱miR-122对J82细胞增殖和侵袭能力的抑制作用，表明miR-122可通过负向靶控CREB1而抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力。

在乳腺癌中，miR-122通过靶向IGF1R调节Akt/mTOR信号途径而发挥作用[16]。Akt的激活或过度表达是肿瘤进展的标志;mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是许多肿瘤细胞增殖、侵袭和其他生物学进程中的关键调节剂[16]。在包括膀胱癌在内的各种肿瘤进展中,Akt/mTOR信号途径均发挥促进作用。本研究结果显示，miR-122可抑制膀胱癌细胞Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平，但是CREB1可以减弱miR-122的这种作用。以上结果均表明，miR-122通过作用靶点CREB1负向调控Akt/mTOR通路，从而抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭。