人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响

陈天琰，张磊，高建一，余佳红，唐彬，胡嘉波

(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在神经炎症疾病如缺血性卒中[1]、阿尔茨海默病[2]和脊髓修复[3-4]中发挥积极作用。异常的慢性炎症是促进神经炎症疾病的关键因素[5]，抑制关键的炎症介质可改善病理状况[6]。中枢神经系统的免疫细胞，如肥大细胞[7]和巨噬细胞[8]等为阿尔茨海默病和多发性硬化症[9]的治疗提供靶标。巨噬细胞具有异质性，M1/M2巨噬细胞的平衡极化影响组织器官在炎症或损伤中的进展[10]。抑制巨噬细胞促炎群体及炎症介质与改善临床症状密切相关[11-12]。已证实NSCs可通过巨噬细胞在抗炎方面发挥巨大免疫调控作用[13]。研究表明，干细胞可以通过旁分泌机制发挥治疗效应[14-15]。但是，神经干细胞微囊泡(neural stem cell microvesicles，NSC-MVs)是否可以调控巨噬细胞极化发挥免疫调节作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究人胚胎干细胞源NSC-MVs在体外对巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚胎干细胞源NSCs由本课题组先前诱导分化所得[15]；人白血病单核细胞株THP-1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

DMEM/F12、RPMI 1640培养基、胎牛血清和B27均购于美国Gibco公司；表皮生长因子(EGF)和重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)均为美国PeproTech公司产品；非必需氨基酸、即用型4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)、Trizol 试剂、小鼠IgG2b K 同型对照Alexa FluorTM488、抗CD86 FITC(美国Thermofisher公司)；基质胶(美国Corning公司)；佛波酯(瑞典ENZO Biochem公司)；脂多糖(LPS，上海昂一生物科技有限公司)；Dil(美国Sigma-Aldrich公司)；逆转录试剂和SYBR Green定量试剂(南京Vazyme公司)；BCA试剂盒，RIPA蛋白裂解液均购自上海碧云天生物技术公司；多克隆兔抗诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，多克隆兔抗精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)，单克隆小鼠抗β-肌动蛋白购于美国Santa Cruz公司；羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗购于杭州联科生物有限公司；实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；CytoFLEX 流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；多维全景流式细胞仪(Flow Sight，美国Merck Millipore公司)；Olympus FV1000激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 细胞培养

NSCs从人胚胎干细胞中诱导分化获得，并在补充有1×B27，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF，1%非必需氨基酸和1% 青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中进行培养。

THP-1细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞接种于6孔板(1.2×106个/孔)，用100 ng/mL佛波酯诱导24 h，在倒置显微镜下对诱导的THP-1巨噬细胞观察拍照，诱导的细胞用于后续实验。

1.3 NSC-MVs提取和浓度测定

参考文献[14],收集NSCs条件培养液，于4 ℃2 000×g离心5 min，取上清液；4 ℃行12 000×g离心15 min去除细胞碎片和杂质；将收集的上清液以100 000×g超速离心2 h；PBS洗涤沉淀，并在相同条件下进行第二次超速离心；弃上清液加入200 μL PBS重悬沉淀，分装于-80℃储存。在20 μL微囊泡中加入等体积的RIPA裂解液，冰上裂解1 h，每隔15 min剧烈振荡；通过BCA检测试剂盒，绘制标准曲线并分析NSC-MVs蛋白含量。

1.4 THP-1内化NSC-MVs

按试剂说明书将NSC-MVs于37 ℃避光环境中用Dil标记30 min；加入1%牛血清白蛋白溶液终止反应，随后PBS洗涤；于4 ℃以100 000×g离心2 h；然后，将标记的微囊泡与THP-1细胞孵育12 h；PBS洗涤2遍；流式细胞仪检测THP-1细胞内荧光表达情况。温育24 h后，用DAPI进行核染色，细胞图像通过Olympus FV1000激光扫描共聚焦显微镜获得。

1.5 THP-1巨噬细胞分组及相关指标检测

1.5.1 实验分组 将THP-1巨噬细胞种于6孔板,并按照如下进行分组：对照组，无血清RPMI 1640培养液孵育；LPS组，100 ng/mL LPS处理6 h，随后PBS洗涤，更换为等量无血清RPMI 1640培养液孵育12 h或24 h；LPS+MVs组，100 ng/mL LPS处理6 h，随后PBS洗涤，加入含各浓度NSC-MVs(0.024,0.12,0.6,3,15 μg/mL)的无血清RPMI 1640培养液孵育12 h或24 h。

1.5.2 实时荧光定量PCR检测THP-1巨噬细胞炎性因子mRNA表达 用各浓度NSC-MVs(0.024，0.12，0.6，3，15μg/mL)或0.12 μg/mL NSC-MVs按照“1.5.1”分组孵育12 h，用Trizol法提取3组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。取2 μL cDNA 以20 μL体系进行实时荧光定量PCR检测，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40个扩增循环。用StepOneTMSoftware v2.3软件进行数据分析，以β-肌动蛋白为内参基因，通过2-ΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。相关引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR相关引物序列

1.5.3 蛋白质印迹法检测THP-1巨噬细胞iNOS和Arg-1蛋白表达 用0.12 μg/mL微囊泡，按照“1.5.1”分组孵育24 h；弃上清液，用预冷PBS洗2遍；每孔加入含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100 μL，细胞刮刀刮取研磨充分；冰上裂解1 h，期间每隔15 min剧烈振荡1次；4℃，12 000×g离心10 min；收集上清液并检测蛋白含量；上清液与上样缓冲液以4 ∶1比例混合，100 ℃热水浴10 min；-20 ℃保存。参考文献[15]行SDS-PAGE，iNOS、多克隆兔抗Arg-1和单克隆小鼠抗β-肌动蛋白均1 ∶500，HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG为1 ∶3 000，ECL显色系统曝光，Lane 1D软件对条带进行扫描并分析其灰度值。

1.5.4 流式细胞术检测THP-1巨噬细胞CD86表达 用0.12 μg/mL微囊泡，按照“1.5.1”分组孵育24 h；弃上清液，用预冷PBS洗涤细胞，0.25%胰酶消化；4 ℃、1 000×g离心5 min，弃上清液，沉淀加入200 μL PBS混匀；加入50 μL含2×105个细胞悬液；按照分组分别加入小鼠IgG2b K 同型对照Alexa FluorTM488、抗CD86 FITC，避光冰上孵育30 min；随后加入1 mL PBS，4 ℃-350×g离心5 min；弃上清液，涡旋振荡，加入PBS重悬细胞沉淀，流式细胞仪检测。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 巨噬细胞形态及内化NSC-MVs观察

如图1所示，THP-1经佛波酯诱导后呈圆形、长梭形改变，或伸出伪足，胞质透亮，界限清楚，贴壁能力强。流式图像显示，多数THP-1巨噬细胞在与Dil标记NSC-MVs共孵育12 h时能有效内化NSC-MVs。激光共聚焦荧光显微镜图像同样显示，共孵育24 h，Dil标记的人胚胎干细胞源NSCs衍生的MVs可以被巨噬细胞内化至THP-1细胞质中。

A：THP-1巨噬细胞形态(×100)；B：流式细胞仪检测THP-1细胞吞噬Dil标记NSC-MVs；流式通道1(CH01)：白光下THP-1细胞；流式通道5(CH05)，Dil标记NSC-MVs；CH01/CH05：吞噬NSC-MVs的THP-1细胞；C：内化NSC-MVs的THP-1巨噬细胞激光共聚焦显微镜图像(×400)图1 巨噬细胞形态及内化NSC-MVs观察

2.2 NSC-MVs抑制巨噬细胞炎症因子表达

如图2所示，与对照组相比，LPS组IL-6mRNA表达水平明显增加(P<0.01)，经0.12 μg/mL和0.6 μg/mL NSC-MVs处理后表达水平显著下降(P<0.01或P<0.05)；而0.024 μg/mL，3 μg/mL和15 μg/mL NSC-MVs组与LPS组相比差异无统计学意义。因此，选择0.12 μg/mL NSC-MVs进行后续实验。

如图3所示，与对照组相比，LPS组THP-1巨噬细胞炎性因子IL-1β，TNF-α，IL-6等mRNA表达水平明显增加(P均<0.01)，经0.12 μg/mL NSC-MVs处理后则显著下降(P均<0.05)。

1：对照组；2：LPS组；3：LPS+0.024 μg/mL MVs组；4：LPS+0.12 μg/mL MVs组；5：LPS+0.6 μg/mL MVs组；6：LPS+3 μg/mL MVs组；7：LPS+15 mg/mL MVs组；a:P<0.01，b:P<0.05图2 qRT-PCR检测不同浓度NSC-MVs处理后各组巨噬细胞IL-6 mRNA表达

图3 qRT-PCR检测各组巨噬细胞IL-1β，TNF-α和IL-6 等mRNA表达

2.3 NSC-MVs抑制巨噬细胞M1极化蛋白表达

蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组相比，LPS组THP-1巨噬细胞iNOS蛋白表达水平明显增加(P<0.01)，Arg-1差异无统计学意义；与LPS组相比，LPS+MVs组iNOS表达显著降低(P<0.05)，Arg-1蛋白表达明显增加(P<0.05)，如图4所示。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，LPS组CD86表达增加，而LPS+MVs组CD86表达较LPS组略低，差异无统计学意义。如图5所示。

图4 蛋白质印迹法检测各组巨噬细胞iNOS和Arg-1蛋白表达

图5 流式细胞术检测NSC-MVs处理巨噬细胞CD86表达

3 讨论

研究表明，持续活化的单核巨噬细胞与神经炎症性疾病的进展密切相关，已证实靶向抑制免疫细胞如巨噬细胞、小胶质细胞的激活，降低巨噬细胞M1活化，具有神经保护作用[16]。单核—巨噬细胞谱系的细胞疗法被认为是有力的神经炎症疾病的免疫调节靶标[17]。同时研究表明，NSCs可以调节神经炎症微环境从而改善脑功能[18]，在治疗卒中、帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤等神经炎症疾病中具有重要意义[19-22]。NSCs移植通过调节巨噬细胞极化下调M1群体从而改善神经功能恢复[13，22]。干细胞的衍生产物，例如条件培养基和微囊泡，具有潜在的治疗作用[23-24]。本组前期结果显示人胚胎干细胞源NSCs-MVs具有生物学活性，在坐骨神经损伤修复[14]和抑制心肌细胞凋亡中发挥积极作用[15]。本研究表明，人胚胎干细胞源NSCs-MVs具有免疫调控作用，能够在体外抑制巨噬细胞M1极化。

本研究流式细胞术结果显示，Dil标记的NSCs-MVs在孵育后12 h即进入THP-1细胞内，共聚焦荧光显微镜更加直观反映孵育后24 h THP-1内化微囊泡情况。巨噬细胞受微环境影响根据表型和功能分为经典活化促炎M1表型和替代活化抑炎M2表型，受LPS刺激后向M1型极化，促炎细胞因子如IL-1，IL-6，TNF-α以及iNOS表达增强等。促炎细胞因子参与神经疾病中炎症过程，iNOS大量增加，催化精氨酸分解生成NO，NO与O2-生成过氧化亚硝酸盐，通过强烈过氧化作用导致细胞死亡和广泛的组织损伤[25]。此外，本研究根据文献[26]用100 ng/mL LPS处理THP-1细胞，LPS处理组巨噬细胞炎性因子IL-1β，TNF-α，IL-6等mRNA表达水平明显增高，iNOS蛋白表达增加；同时发现0.12 μg/mL NSC-MVs能够有效降低LPS处理后巨噬细胞IL-6，IL-1β，TNF-α等mRNA表达，诱导iNOS蛋白和Arg-1蛋白表达升高。由此表明，NSC-MVs能够抑制THP-1巨噬细胞M1极化相关炎症因子和主要标志蛋白的表达。此外，LPS处理有增加CD86表达的趋势，经NSC-MVs处理后CD86表达水平降低，但是无统计学意义，考虑为100 ng/mL LPS对于THP-1巨噬细胞表面标志的诱导作用不明显。

本研究表明，人胚胎干细胞源NSCs-MVs能够减少THP-1细胞炎性细胞因子和iNOS表达，抑制巨噬细胞M1表型发挥其抗炎作用。