张力蛋白1抑制非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭

任琎，曹一鑫，王德强，庄秀芬，李小琴

(江苏大学附属医院肿瘤内科，江苏 镇江 212001)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最主要的肺癌类型，复发率高，预后差[1-2]。抑癌基因的缺失与肺癌细胞的增殖、转移密切相关[3-4]。张力蛋白(tensin,TNS)家族是一种多结构域蛋白，可与细胞膜交互作用，是联系细胞外基质、肌动蛋白骨架的重要成分，亦可结合酪氨酸激酶受体，影响细胞信号转导，在细胞黏附、运动、生长等细胞生物学活动中发挥着重要的作用[5]。TNS1是一种定位于胞质灶性黏附区域的磷酸蛋白[6]。已有研究报道，TNS1与乳腺癌、胃癌转移有关，并显著影响乳腺癌、胃癌患者的预后[7-8]。然而，TNS1在NSCLC发病过程中是否发挥作用目前并不清楚。本研究通过比较TNS1在NSCLC组织和细胞中的表达，分析其与NSCLC患者临床病理特征及预后的关系；探讨外源性上调TNS1表达对NSCLC细胞生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例 收集2010年1月至2015年12月于江苏大学附属医院胸外科行部分肺叶切除的56例NSCLC患者肺癌组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘>5 cm)。其中，男35例，女21例。年龄18～78岁，所有患者术前均未行放疗、化疗，所有标本均经过病理证实。其中，鳞癌23例，腺癌33例。本研究通过江苏大学附属医院伦理学委员会批准，患者均知情同意。

1.1.2 试剂及仪器 人正常支气管上皮16HBE、人肺腺癌A549和H1299细胞均购自中国科学院上海细胞生物研究所；RPMI 1640培养基、DMEM、小牛血清(美国Hyclone公司)；MTT(美国Sigma公司)；过表达TNS1的质粒(pcDNA3.1/TNS1)及相应的空载质粒(pcDNA3.1)购自上海英骏生物技术有限公司；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；荧光实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；羊抗人TNS1单抗(美国Abcam公司)；兔抗人E-钙黏蛋白、波形蛋白单抗(美国BD Biosciences公司)；羊抗兔HRP耦联二抗(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 A549和H1299肺癌细胞培养、分组与转染 在37 ℃、5% CO2条件下，将A549和H1299细胞置于含10%小牛血清的1640培养液中培养；16HBE细胞置于含10%小牛血清的DMEM中培养。取对数生长期A549和H1299细胞，并于转染前24 h 接种至6孔板(3×105个/孔)，待细胞生长融合度达70%～80%时进行转染。依照转染说明书，将4 μg过表达质粒转染入A549和H1299细胞中(分别命名为A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1)，另转染空载质粒pcDNA3.1作为阴性对照组(分别命名为A549/pcDNA3.1和H1299/pcDNA3.1)，用于后续相关实验检测。

1.2.2 qRT-PCR检测TNS1mRNA表达 通过Tri-zol提取组织和细胞总RNA，行反转录获得cDNA，然后对产物进行扩增。GAPDH引物序列上游：5′-GCAAATTCCATGGCACGTC-3′，下游：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′；TNS1引物序列上游：5′-GTGCAAAGGGGACTGAATTCG-3′，下游：5′-GGCTACAAGACTCTCCAAGTGG-3′[9]。PCR 反应条件：90 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算TNS1mRNA相对表达量。根据NSCLC组织中TNS1mRNA相对表达量的中位数，将NSCLC 患者分为TNS1低表达组(≤中位数)和高表达组(>中位数)。

1.2.3 MTT比色法实验检测细胞抑制率 取“1.2.1”转染后各组细胞，接种于96孔板，每孔2×103个，每组6个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养72 h；每孔加MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h；弃上清液，加DMSO 150 μL/孔，振荡溶解10 min；待紫色结晶完全溶解后，于酶标仪490 nm处检测各孔光密度(D)值，计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(1-实验组D值/对照组D值)×100%。

1.2.4 细胞集落形成实验检测细胞增殖能力 取“1.2.1”细胞，按1×103个/孔接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育10～14 d；纯甲醇固定10 min；加入0.1%结晶紫染液，室温染色10～15 min；孔板洗净并干燥后，肉眼计数克隆数。

1.2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取“1.2.1”转染后细胞，接种于6孔板，每孔5×105个细胞，于37 ℃、5% CO2条件下培养过夜；待细胞融合度为80%～90%时，弃培养基并用灭菌的200 μL加样枪头在单层细胞上中间纵向垂直划痕；用PBS轻柔清洗细胞3次，去除划下的细胞；每孔加入含10 %胎牛血清的1640培养液2 mL；分别于0、24和48 h在高倍镜下(100×)随机取6个视野划痕处拍照。迁移率=(迁移前两线间的长度-迁移后两线间的长度)/迁移前两线间的长度×100%。

1.2.6 Transwell实验检测细胞的侵袭能力 取“1.2.1”转染后细胞，以无血清1640培养液重悬，Transwell培养板上室内加入300 μL细胞悬液(5×104个)，下室加入1 mL含10%胎牛血清的1640培养液；培养48 h后取出小室，用湿棉签擦去内部基底膜上表面的细胞，预冷甲醇固定30 min，苏木精染色1 min，在高倍镜下(400×)随机取6个视野计数，取平均数。

1.2.7 蛋白质印迹法检测细胞TNS1、E-钙黏蛋白和波形蛋白表达 用全蛋白裂解液提取待测细胞总蛋白，冰浴30 min，离心后取上清液，BCA法行蛋白定量；分别取50 μg样品行SDS-PAGE，60 mA电泳4 h；电压80 V将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入相应一抗TNS1 (1 ∶100)、E-钙黏蛋白(1 ∶250)、波形蛋白(1 ∶200)、GAPDH(1 ∶1 000，内参)，4 ℃孵育过夜；TBST漂洗4次，每次10 min；加入相应二抗(1 ∶3 000)室温孵育2 h；ECL敏感发光试剂(美国Invitrogen公司)，曝光显影。采用Image J软件处理结果图像。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 TNS1 mRNA在NSCLC癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

如图1所示，与癌旁组织相比，NSCLC癌组织中TNS1mRNA表达明显下降(t=-2.195，P<0.05)。由表1可见，TNS1mRNA表达量与NSCLC 患者淋巴结转移及术后远处转移相关(χ2=4.45和7.42，P均<0.05)，淋巴结转移及术后出现远处转移的患者TNS1mRNA呈低表达，而性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、病理分型、术后TNM分期与TNS1mRNA表达水平未见明显相关(P均>0.05)。

表1 TNS1 mRNA表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

图1 qRT-PCR检测NSCLC癌旁组织和癌组织中TNS1 mRNA表达

2.2 NSCLC癌组织中TNS1表达与患者预后的关系

在TCGA数据中，TNS1mRNA高表达肺腺癌患者的总体生存率显著优于TNS1mRNA低表达肺腺癌患者(P=0.019)，见图2。

图2 TCGA数据库中TNS1 mRNA高表达与低表达肺腺癌患者的总体生存曲线

进一步对我院56例肺腺癌术后患者进行随访，随访时间为3.5～47.3个月，中位随访时间为21.3个月。TNS1mRNA高表达患者3年累积无病生存率和累积总体生存率明显优于TNS1mRNA低表达患者(χ2=5.770和3.950，P=0.016和0.047)。见图3。

图3 NSCLC癌组织中TNS1 mRNA高表达与低表达患者的累积无病生存曲线和累积总体生存曲线

2.3 TNS1在不同肺癌细胞中的表达

由图4可见，A549和H1299细胞中TNS1mRNA和蛋白表达量明显低于16HBE细胞(P均<0.01)。质粒pcDNA3.1/TNS1转染A549和H1299细胞48 h后，qRT-PCR检测显示，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1组细胞TNS1mRNA和蛋白表达量明显高于相应对照组 (P均<0.01)。

①：A549/pcDNA3.1;②：A549/pcDNA3.1/TNS1;③:H1299/pcDNA3.1;④:H1299/pcDNA3.1/TNS1图4 qRT PCR和蛋白质印迹法检测不同细胞中TNS1 mRNA和蛋白表达

2.4 TNS1对A549和H1299细胞增殖能力的影响

由图5可见，在48、72 h，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1组细胞增殖能力均明显低于对照组(P<0.05和P<0.01)，表明pcDNA3.1/TNS1转染组细胞生长受到抑制。克隆形成实验显示转染pcDNA3.1/TNS1组A549细胞和H1299细胞克隆形成能力均明显低于对照组(t=-7.865和-8.877，P均<0.01)，见图6。由此可见，TNS1可抑制A549和H1299细胞的增殖能力。

a：P<0.05，b：P<0.01，与同时间点A549/pcDNA3.1比较；c：P<0.05，d：P<0.01，与同时间点H1299/pcDNA3.1比较图5 MTT法检测A549和H1299细胞增殖能力

图6 克隆形成实验检测A549和H1299细胞增殖能力

2.5 TNS1对A549和H1299细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，在24、48 h，与对照组相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1组细胞迁移细胞数量明显减少，迁移速度明显减慢(P均<0.01) ，见图7。由此说明，上调TNS1表达可明显抑制A549和H1299细胞的迁移能力。

①：A549/pcDNA3.1；②：A549/pcDNA3.1/TNS1；③：H1299/pcDNA3.1；④：H1299/pcDNA3.1/TNS1图7 划痕实验检测A549和H1299细胞迁移能力

2.6 TNS1对A549和H1299细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示，与对照组相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1组穿透基膜的细胞数明显减少(t=-6.585和-7.637，P<均0.01)。由此说明，上调TNS1表达可明显抑制A549和H1299细胞的侵袭能力。见图8。

图8 Transwell实验检测A549和H1299细胞的侵袭能力(×200)

2.7 TNS1 mRNA对E-钙黏蛋白和波形蛋白的调控作用

蛋白质印迹法结果显示，与对照组相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1组细胞中E-钙黏蛋白表达水平明显增加(t=3.112和3.579，P均<0.01)，波形蛋白表达明显降低(t=-4.757和-3.187，P均<0.01)。见图9。

①：A549/pcDNA3.1;②:A549/pcDNA3.1/TNS1；③ H1299/pcDNA3.1;④ H1299/pcDNA3.1/TNS1图9 蛋白质印迹法检测E-钙黏蛋白和波形蛋白表达

3 讨论

以往研究表明，TNS参与调节多种肿瘤细胞生物学活动，包括细胞黏附、迁移、增殖等，与肿瘤患者预后相关[10]。Zhan等[7]研究发现，TNS1在转移性乳腺癌组织中表达显著降低，且TNS1高表达患者无转移生存时间显著长于低表达患者。曹一鑫等[8]报道胃癌肿瘤转移患者TNS1蛋白表达率低于未发生转移患者，是胃癌独立的保护性预后因素。本研究发现，TNS1mRNA在NSCLC组织中的表达低于癌旁组织，且与NSCLC患者淋巴结转移及术后肿瘤转移相关；淋巴结转移与远处转移是预后不良的表现，由此提示TNS1可能参与NSCLC细胞增殖与转移。此外，TNS1mRNA高表达患者3年累积无病生存率和累积总体生存率均优于低表达患者。由此表明，TNS1mRNA低表达促进肺癌患者术后复发,与患者不良预后有关。

此外，本研究体外实验结果证实，上调TNS1表达可显著抑制肺癌A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭能力。有研究发现，携带TNS1特定突变基因型的乳腺癌MDA-MB231细胞系迁移和侵袭能力增强[6]，提示TNS1可抑制乳腺癌细胞转移。Zhan等[7]研究亦证实，干扰TNS1表达可增强多种乳腺癌细胞系的侵袭能力，与乳腺癌细胞增殖及侵袭活性密切相关。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切关系[11]。当肿瘤细胞发生EMT，表现为上皮表型如角丝蛋白、E-钙黏蛋白逐渐丧失，而间质表型如波形蛋白、纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白的表达增加，与周围细胞和基质接触减弱，导致肿瘤细胞迁移和运动能力增强[12]。EMT是肿瘤侵袭转移的关键机制，本研究结果显示，TNS1高表达可引起NSCLC细胞E-钙黏蛋白表达上调和波形蛋白表达下降，从而推测TNS1高表达可抑制EMT过程，负性调控NSCLC细胞侵袭和转移。肿瘤细胞的增殖和迁移涉及多种细胞因子和多条信号传导通路，Shinde 等[13]研究表明，转谷氨酰胺酶-2和TNS1共同参与乳腺癌细胞EMT的过程。Zhan等[7]研究证实，乳腺癌细胞中TNS1表达下降促进Rho-GTP酶家族成员Cdc42基因活化，Cdc42可能是TNS1影响乳腺癌肿瘤细胞增殖能力的靶基因。关于TNS1对NSCLC细胞转移具体的调控机制尚有待进一步研究。

综上所述，TNS1在NSCLC组织中呈低表达，且与肺癌患者淋巴结转移、术后远处转移及患者的不良预后有关，其可抑制肺癌细胞增殖和迁移，提示TNS1可作为NSCLC转移发生的潜在指标。