IFN-γ在多囊卵巢综合征中的表达及对卵巢颗粒细胞的影响

张丽娜，王娟，姚雪，李春梅，史兵伟，夏圣

(1.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；2.常州市中医医院检验科，江苏 常州 213003)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种常见的内分泌激素紊乱性疾病，多发于育龄期女性。临床上PCOS患者主要以高雄性激素、肥胖、多毛、不孕为主要特点，同时患者常伴有月经紊乱、卵巢功能失衡。卵巢颗粒细胞与卵母细胞关系十分密切,可供给卵母细胞生长发育所需的85%的营养[1]，影响着卵泡的启动、发育、成熟及闭锁。有研究表明，高雄激素可抑制颗粒细胞的增殖及卵母细胞的成熟[2]。Nehir等[3]发现炎症因子与PCOS患者的高雄激素血症密切相关。研究表明，PCOS患者体内有部分炎症因子表达水平明显上调[4-6]。但是，炎性因子对颗粒细胞产生的影响及在PCOS发病中的作用还不明确。本研究拟检测PCOS患者外周血中炎症因子IFN-γ的表达水平，并探讨IFN-γ对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响，以期探究IFN-γ在PCOS疾病发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本采集 收集31例2016年11月至2017年6月在常州市中医医院初诊、年龄为21～34岁的PCOS患者和22例年龄匹配的健康志愿者血液标本。所有PCOS患者的诊断都符合鹿特丹诊断标准[7]：① 低排卵/无排卵；② 临床症状和(或)生化检查表现为高雄激素血症；③ 超声显示多囊卵巢的存在，符合3 项中的2项，并排除如先天性肾上腺增生、非经典肾上腺增生、库欣综合征、分泌雄激素肿瘤、特发性雄激素过多症、特发性多毛症，高催乳素血症和甲状腺疾病等其他疾病。健康志愿者符合以下条件：① 有规律的月经周期；② 性激素水平正常；③ 无代谢性或炎症性疾病。所有受试者均未接受治疗。本研究获常州市中医医院伦理委员会通过，患者及家属均知情并签署知情同意书。

1.1.2 实验细胞及试剂 人卵巢颗粒细胞瘤KGN细胞(上海江林生物科技有限公司)；人IFN-γ(上海达科为生物技术有限公司)；细胞刺激剂试剂盒(Leuko Act Cktl with GolgiPlug)、抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5、抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC、人Th1/Th2细胞因子试剂盒(美国BD公司)；Fix &Perm破膜剂(美国Nordicmubio公司)；细胞周期试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)；APC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(福麦斯生物技术有限公司)；羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)细胞增殖试剂盒(美国Thermo公司)；RPMI-1640、DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国 Gibco 公司)；青链霉素混合液(美国Sigma公司)。

1.2 细胞培养

KGN细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗(100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素混合液)的DMEM/F12培养液中，细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每48 h换1次新鲜培养液。

1.3 外周血单个核细胞(PBMC)的分离制备

PCOS患者和对照组肝素抗凝肘静脉血，3 500 r/min常温离心5 min，收取血浆并于-80 ℃保存。余下细胞加入等体积的PBS稀释，轻轻颠倒混匀后，轻柔逐滴滴入到预先加入的等体积Ficoll淋巴细胞分离液液面上，2 000 r/min常温离心20 min。吸取PBMC所在细胞层的细胞，转入新离心管中，加入PBS，2 000 r/min离心10 min洗涤。共洗涤3次，去上清液后，将细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，用于后续实验。

1.4 流式细胞仪分析Th1、Th2细胞

将细胞计数后，接种于24孔板内，每孔加细胞刺激剂，给予5 h刺激后，收集细胞；PBS清洗后依次加入抗CD3-FITC、抗CD8-PerCP-cy5.5抗体，染色30 min；PBS清洗后，加破膜剂试剂A，室温静置15 min；PBS清洗后，加入破膜剂试剂B和抗IFN-γ-PE、抗IL-4-APC抗体，染色45 min；PBS清洗后加入200 μL PBS，上流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)检测。用CD3+、CD8-抗体反圈门，CD3+CD8-IFN-γ+的细胞为Th1细胞，CD3+CD8-IL-4+的细胞为Th2细胞。设置同型对照用于消除抗体与细胞非特异性结合所产生的背景染色。数据采用Flowjo软件进行分析。

1.5 血浆中IL-4、IL-6、IFN-γ的表达水平流式细胞仪CBA法检测

血浆中细胞因子的检测采用流式细胞小球微阵列术(cytometric bead array,CBA)法。首先制备混合微球液，流式EP管中依次加入50 μL预处理好的混合微球液、50 μL的样本和各浓度标准品、50 μL的藻红蛋白荧光抗体，充分混匀，室温避光孵育3 h。每管加1 mL 缓冲液，1 800 r/min离心5 min；弃上清液，最后加入120 μL 缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测。标准曲线用FACS Array3.0分析软件绘制，根据标准曲线计算出血浆中各种细胞因子的浓度。

1.6 CFSE标记法检测KGN细胞增殖

培养KGN细胞，待细胞处于对数生长期时用胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS调整细胞悬液浓度至2×106/mL。将调整好细胞密度的单细胞悬液与等体积CFSE工作液混合，使CFSE的终浓度为 2.5 μmoL/L，充分混匀后，避光、室温静置10 min。加入含10%胎牛血清DMEM/F12培养液终止反应，1000 r/min离心5min，弃上清液；加入PBS 1000r/min离心5 min，弃上清液，共洗涤细胞2次。将CFSE标记的KGN细胞悬液以每孔6×104个细胞接种于6孔板中，培养1～2 d后，待细胞生长至合适密度时，将KGN细胞分为对照组(常规培养)和干扰素处理组(加入250 ng/mL IFN-γ)，继续培养72 h，收集两组细胞。分别加入2 μL 7-AAD染色液，流式细胞仪检测7-AAD阴性的KGN细胞增殖情况。重复实验3次。

1.7 流式细胞术检测细胞周期

培养KGN细胞，待细胞处于对数生长期时消化收集细胞，每孔以5×104个细胞接种于6孔板内预培养1～2 d。将KGN细胞分为对照组(常规培养)和干扰素处理组(加入250 ng/mL IFN-γ)，继续培养72 h，收集两组细胞并用PBS洗涤2遍。分别加入2 mL 70%冷乙醇固定细胞，轻轻混匀，4 ℃过夜。1 500 r/min离心5 min，去除固定液，加预冷的PBS洗涤细胞，洗涤2～3次。依次加入100 μL细胞周期试剂A、100 μL试剂B和150 μL试剂C，轻柔混匀，室温放置15 min。检测前用300目尼龙筛网过滤，流式细胞仪检测。重复实验3次。

1.8 流式细胞术检测IFN-γ诱导的细胞凋亡

培养KGN细胞，待细胞处于对数生长期时，消化收集细胞以每孔6×104个细胞培养于6孔板内，将KGN细胞分为对照组(常规培养)和干扰素处理组(加入250 ng/mL IFN-γ)，分别在0、24、48、72 h显微镜观察细胞生长状态，确定流式检测细胞凋亡的最适时间。收集对照组与干扰素处理组处理48 h后的细胞，并用PBS洗涤2遍，加250 μL 结合缓冲液重悬细胞使其终浓度为1×106/mL。取100 μL细胞悬液，加入2.5 μL Annexin V/Alexa Fluor 647、5 μL 20 μg/mL的碘化丙锭溶液，混匀、避光孵育15 min，加400 μL PBS上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 PCOS患者的超声诊断特征

超声可见PCOS患者至少一侧卵巢存在≥12个直径为2～9 mm的小卵泡，和(或) 卵巢体积>10 cm3。见图1。

图1 健康志愿者和PCOS患者卵巢超声影像

2.2 流式细胞仪检测PBMC中Th1、Th2细胞比例

与对照组相比，PCOS患者血浆中Th1比例明显上调，Th2细胞的比例差异不明显(图2A、2B)。结果显示，PCOS患者血浆中Th1的比例较对照组明显升高(t=9.506，P<0.01)；而Th2细胞在两组中的比例无明显差异(图2C、2D)。

A：Th1细胞流式分析；B：Th2细胞流式分析；C：PBMC中Th1细胞结果分析；D：PBMC中Th2细胞结果分析图2 流式细胞仪检测PCOS患者外周血中Th1、Th2细胞比例

2.3 血浆中IL-4、IL-6、IFN-γ的流式细胞仪定量检测

结果显示，两组IL-4比较差异无统计学意义，PCOS组IL-6和IFN-γ水平均高于对照组，差异有统计学意义(t=-3.029，P<0.01；t=-2.306，P<0.05)。见图3。

图3 流式细胞仪CBA法检测PCOS患者血浆中IL-4、IL-6、IFN-γ水平

2.4 IFN-γ对KGN细胞增殖的影响

流式分析时，先对KGN细胞设门分析，去除样本中的细胞碎片；再对7-AAD阴性细胞设门，以排除死细胞的影响，继而分析KGN细胞CFSE的荧光强度。结果显示，干扰素处理组KGN细胞的增殖较对照组右移，表明KGN细胞在加入干扰素处理后可抑制KGN细胞的增殖。见图4。

图4 KGN细胞增殖的CFSE流式细胞仪检测

2.5 IFN-γ对KGN细胞周期影响

流式分析时，先对KGN细胞设门，去除细胞碎片；再对细胞周期分析的单细胞群体设门，去除黏连细胞，继而分析单细胞中处于各细胞周期的细胞比例。结果显示，与对照组相比，干扰素处理的KGN细胞中处于G0-G1期细胞比例增加，S期和G2-M期细胞比例均下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。表明KGN细胞在加入干扰素处理后，细胞周期被阻滞在G0-G1阶段。见图5。

图5 IFN-γ对KGN细胞周期影响

2.6 IFN-γ对KGN细胞凋亡的影响

使用250 ng/mL IFN-γ对KGN细胞处理24 h后，干扰素处理组与对照组比较无明显差异；处理48 h后，与对照组相比，干扰素处理组细胞增殖的速度和密度降低；处理72 h后，干扰素处理组细胞密度明显降低，细胞发生退化现象。收集培养48 h细胞检测细胞凋亡水平，流式分析结果显示，处理48 h后，干扰素处理组早期凋亡比例与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；干扰素处理组晚期凋亡比例与对照组相比明显增加，差异有统计学意义(t=-11.667，P<0.01)。见图6。

A：IFN-γ刺激KGN细胞不同时间后的细胞形态观察(×40)；B：IFN-γ刺激KGN细胞48 h细胞凋亡图6 IFN-γ对KGN细胞凋亡的影响

3 讨论

PCOS是一种育龄期女性的内分泌紊乱性疾病，影响着5%～10%的女性身体健康，给处于生育期的妇女带来了极大的困扰[8]。研究表明，PCOS患者IL-6、PAI-1、CRP、TNF-α等炎症因子表达水平升高[9-10]；Qin等[11]发现PCOS患者卵泡液中IFN-γ、IL-2细胞因子水平明显上调。本研究通过流式细胞仪检测PCOS患者和健康对照组外周血中Th1、Th2型细胞的比例，结果显示，与对照组相比，PCOS患者外周血中IFN-γ+Th1型细胞比例明显上调，IL-4+Th2型细胞比例则无明显差异。Gong等[12]在研究PCOS妇女Th1/Th2免疫失衡与肥胖的关系时发现，PCOS患者体重指数和腰围升高时，Th1/Th2比值升高，PCOS患者全身免疫向Th1免疫转移。Nasri等[13]研究不育PCOS患者体内Th细胞之间的平衡关系时发现，Th细胞免疫平衡的改变可能导致不孕。复发性流产、先兆子痫等妊娠并发症患者Th1升高、Th2应答降低[14-15]。

本研究结果显示，PCOS患者血浆中IFN-γ水平升高，与最近有学者发现的PCOS患者血清中IFN-γ水平低于对照组的结果存在偏差，可能是由于不同研究所选患者的疾病进程及患者入组时的条件差异所致。Xie等[17]通过PCOS鼠模型发现，PCOS小鼠脾脏IFN-γ+Th细胞比例以及IFN-γ+CD19+B细胞比例增加，子宫及卵巢组织中IFN-γ的表达水平升高，本研究结果与其一致。PCOS患者常见的临床特征有胰岛素抵抗、高雄激素血症及卵巢功能紊乱等，炎症因子介导的信号通路转导可通过阻滞胰岛素受体酪氨酸激酶活性，诱导胰岛素抵抗的形成，继而干扰肝脏性激素结合球蛋白合成，间接引起高雄激素血症[18-19]。也有研究表明，炎症细胞因子水平与PCOS患者体内下丘脑-垂体-性腺轴平衡密切相关，可通过影响性激素分泌，阻滞卵泡发育和排卵[20]。

Th1细胞是CD4+T细胞的一个亚群，活化后可分泌包括IFN-γ在内的多种促炎因子，在自身免疫性内分泌疾病的发生发展中起重要作用[21]。有研究发现，炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α能抑制人颗粒细胞增殖，诱发颗粒细胞凋亡[22]。本研究结果表明，IFN-γ不但抑制KGN细胞增殖，也可诱导KGN细胞凋亡。在整个卵母细胞发育过程中，围绕卵母细胞的颗粒细胞主要提供卵母细胞营养物质及生长调节剂[23]。若颗粒细胞发生凋亡，可能会导致卵母细胞核成熟延迟[24]。PCOS患者因“促卵泡刺激素-颗粒细胞轴”功能低下、颗粒细胞凋亡、芳香化酶功能低下不能将卵泡内膜细胞合成的雄激素转化成雌二醇,从而引起体内雄激素积累过多、卵泡发育中途停滞，最终导致优势卵泡选择发生障碍。PCOS患者体内有较多直径为2～9 mm的窦卵泡停止生长，使卵巢形成多囊状改变。

综上所述，PCOS患者体内IFN-γ水平上调，IFN-γ可抑制KGN细胞增殖并促进KGN细胞凋亡。因此，T细胞介导的活化及其分泌的IFN-γ可能在PCOS发病中起一定作用，为PCOS的诊断与治疗提供了理论依据。