基因编辑技术在提高猪瘦肉率中的应用

任红艳，王紫君，舒 畅，华再东，毕延震

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064）

肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是肌细胞分泌的蛋白激素，对成肌细胞的生长和发育起负调控作用［1］。在自然界中已经发现具有双肌型性状的动物，其肌肉量明显多于正常动物，分析发现其MSTN基因自然变异失活了［2］。Lee等［3］通过敲除MSTN，成功获得了具有双肌型的小鼠，进一步说明了该基因与动物的肌肉量有关。另外，还有研究表明胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor-2，IGF2）第三内含子（intron3）的G3072A位点的单碱基突变（G→A）同样导致了瘦肉率的提升［4］。自然突变的动物经过选育后形成了新的品种，其肉质柔软、蛋白质含量较高，很受消费者青睐，但自然突变所需时间很长。随着基因编辑技术的飞速发展，研究者发现可以利用该技术进行定点基因编辑，大大缩短了选育时间，且安全性有一定保障。

1 基因编辑技术概述

随着近些年第一代基因编辑技术锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）和第二代基因编辑技术转录激活样效应因子核酸酶（Transcription activatorlike effector nucleases，TALEN）的发展及应用，第三代基因编辑技术规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9）应 运 而生，并因其操作简单，DNA双链断裂（Double-strand break，DSB）效率较高而得到了飞速发展［5，6］。CRISPR/Cas9只需要Cas9蛋白和向导RNA（guide RNA，gRNA）即可按照自己的意愿完成定点DSB，并通过细胞自身的非同源末端连接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［7］通路发生Indel，从而产生移码突变完成基因敲除，或通过同源重组（Homologous recombination，HR）［8］通路与同源臂供体（donor）完成定点基因敲入。通过以上技术可完成相关基因的失活，从而较快地得到MSTN基因编辑动物。但CRISPR/Cas9可能会脱靶从而引入潜在不需要的DSB，导致生物安全性问题，随着技术的发展，后面又出现了更加安全的不发生DSB的碱基编辑技术（Base editing）和全新的精准基因编辑（Prime editing）等方法。

2 基因编辑在提高猪瘦肉率中的应用

中国是世界上养猪最多和猪肉食用量最大的国家，每年却要大量进口外国种公猪或其精子，主要是因为中国猪普遍具有饲料报酬低、贮脂力强、瘦肉率低等许多缺点，现代人们喜食瘦肉，中国不得不大量进口瘦肉率较高的外国猪以满足人们越来越高的需求。因此亟需培育高瘦肉率的本土猪，但常规选育通常费时费力，随着基因编辑技术的飞速发展，这一高速便捷的分子育种方式得以应用。

MSTN基因包括3个外显子和2个内含子（NCBI），第三外显子最终决定了起作用的肌肉抑制素成熟肽，故一般破坏第三外显子以失活MSTN。IGF2基因包括9个外显子和8个内含子（NCBI），研究表明是第三内含子的单碱基突变导致瘦肉率提高。本文对通过CRISPR/Cas9、Base editing和Prime editing等方法敲除MSTN基因和突变IGF2基因以得到高瘦肉率猪进行综述。

2.1 CRISPR/Cas9的应用

2012年人类就开始研究CRISPR/Cas9［9］，由于人类已经弄清楚提高瘦肉率与MSTN基因失活密切相关，所以便开始利用此技术开展MSTN敲除的研究，以期获得高瘦肉率猪，但该技术对于IGF2的单碱基突变则无能为力。获得基因敲除动物一般有以下途径：通过显微注射gRNA和Cas9 mRNA到受精卵中获得基因编辑动物（通常用于小型动物），或通过先制备基因敲除细胞再进行体细胞克隆得到基因编辑动物（通常用于大型动物）。运用CRISPR/Cas9使MSTN失活主要有以下3种方法：①单gRNA产生单DSB法利用Indel发生移码突变使其失活；②双gRNA产生双DSB法利用较大片段的丢失使其失活；③通过基因敲入荧光报告系统辅助筛选阳性细胞和Cre/LoxP重组系统删除荧光标记残留34bp序列达到翻译错误使其失活等。

2015年，湖北省农业科学院畜牧兽医研究所运用CRISPR/Cas9技术，通过单gRNA法获得了MSTN基因敲除细胞系，并通过体细胞克隆得到了中国首例超级瘦肉猪——中超916新品系［10］。2017年，该所又利用CRISPR/Cas9基因敲入和Cre/LoxP技术连用获得了猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系［11］。2019年，该所利用双gRNA法且无选择标记法获得了MSTN双等位基因纯合子敲除细胞系，并得到了克隆猪。

通过以上方法，虽可以较为快速地获得MSTN敲除动物，但由于产生了DSB，存在潜在的脱靶等生物安全性问题，需要进一步寻找更加安全的技术。

2.2 Base editing的应用

由于常规CRISPR/Cas9有产生DSB的不利性，不产生DSB的基因编辑改进型——碱基编辑应运而生［12］。碱基编辑分为胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor，ABE）。最新的CBE4和ABE4编辑器基于CRISPR/Cas系统，通过在nCas9上连接上胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶形成融合蛋白，即可完成C-T（G-A）或A-G（T-C）的碱基替换，从而实现单碱基编辑。相较于常规CRISPR/Cas9基因编辑，该碱基编辑不会发生DSB，所以理论上不会出现潜在的DNA脱靶而产生永久的DNA编辑，提高了生物安全性。

许多人类疾病都与碱基突变有关，所以该方法对于基因疾病的治疗有巨大的发展潜力。同时，此方法正好可以与IGF2的单碱基突变相结合，以获得IGF2-G3072A位点的单碱基编辑细胞系，从而获得具有高生物安全性的高瘦肉率基因编辑猪。除此之外，还可以利用单碱基编辑在MSTN基因上引入提前终止密码子以达到基因敲除的效果。

然而，2019年中国科学院神经科学研究所杨辉团队在Science发表的GOTI技术发现单碱基编辑存在大量不可预测的脱靶［13］，随后该团队通过定点突变来优化编辑工具，获得了高编辑效率且低脱靶性的新型碱基编辑工具，从而可以获得更具生物安全性的基因编辑猪。

2.3 Prime editing的应用

单碱基编辑由于没有DSB，降低了DNA脱靶，但其只能实现单个碱基的固定替换，具有一定的局限性。2019年Anzalone等［14］发明了全新的精准基因编辑工具PE（Prime Editors），最新的PE3/PE3b编辑器基于CRISPR/Cas系统，通过在Cas9/nCas9上连接上逆转录酶形成融合蛋白，即可完成碱基变换/碱基插入与删除，是一种比较全面的编辑工具。该编辑不需要DNA模板就可以实现12种单碱基的自由变换，而且还能实现最多44 bp的插入和80 bp的删除。相较于传统的CRISPR/Cas9，同样没有引入DSB而具有较高生物安全性，与碱基编辑相比其可以进行单碱基的自由变换，同时还可以进行定点删除和插入，应用十分广泛，在基因编辑领域带来了重大变革。与基因编辑猪相结合，可以利用该系统对猪MSTN进行碱基的删除或插入从而引起移码突变导致其失活，或通过碱基变换引入提前终止密码子导致其失活；另外，还可以运用该系统对IGF2-G3072A位点进行碱基变换，从而得到单碱基编辑细胞系。该系统还可以用于与影响猪瘦肉率的相关基因的研究，最终获得高瘦肉率且高生物安全性的基因编辑猪。除此之外，该系统在人类基因疾病的治疗上也具有广泛的前景。但该系统以逆转录酶为主要原件，在细胞内过量表达，其生物安全性仍然是一个需要考虑的问题。

3 展望

随着基因编辑技术的飞速发展，出现了越来越多简单易操作、运用广泛且安全的新型编辑技术，可以快速获得单碱基编辑、基因敲除或敲入的细胞系，并通过体细胞克隆等技术获得基因编辑动物。运用以上技术达到分子育种的目的，以快速获得具有优良性状的动物。在获得高瘦肉率的优良性状猪上，基因编辑在其中扮演着十分重要的角色，相信随着基因编辑技术的发展与完善，可以为人类生活做出更大的贡献。