抑制EGFR信号通路对骨折愈合早期骨内、外膜来源干细胞增殖、分化能力影响的研究*

王华松兰生辉庞炯宇丰瑞兵杨晨曦袁功武曾文波

骨折在日常生活中十分常见，随着人们经济水平的提升，越来越多的骨折患者愿意接受正规治疗，以获得更好的骨折愈合效果、更早的康复锻炼。但美国骨科医师学会指出，仍有5%～10%的骨折患者出现了骨折延迟愈合或骨不连[1-2]，这大大拖慢了患者回归正常生活的脚步。近年来，随着对信号通路领域的深入探索，研究者发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路与骨膜内的干细胞（stem cells，SCs）关系密切[3]，而此类干细胞正是成骨细胞、成软骨细胞的前身，是骨折愈合过程中的核心角色。故本次研究通过使用EGFR信号通路抑制剂Gefitinib干预股骨干骨折大鼠，旨在探索抑制EGFR信号通路对骨折愈合早期骨内、外膜来源SCs的增殖、分化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康的SPF级SD大鼠50只（1月龄），雄性，体重104～115（109.7±3.2）g[湖北省实验动物研究中心提供，SCXK(鄂)20-150018]。实验前适应性饲养1周。

1.1.2 主要试剂与仪器

Gefitinib、甲基纤维素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、水合氯醛、PBS缓冲液、-巯基乙醇、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、L-抗坏血酸、L-脯氨酸、丙酮酸钠、FITCBrdU细胞增殖检测试剂盒（武汉英颢科技有限公司）、-MEM完全培养基、胰酶、胎牛血清、成骨诱导液（Gibco公司，美国），FITC-CD29、FITC-CD34、FITC-CD45、FITCCD90（上海恒斐生物科技有限公司），von Kossa染液、阿尔新蓝染液（武汉赛维尔生物科技有限公司），地塞米松、-甘油磷酸钠、胰岛素、维生素C（Sigma公司，美国），1×ITS、TGF-3（北京百奥莱博科技有限公司）。CO2恒温培养箱、流式细胞仪（Thermo公司，美国）、光学显微镜（上海光学仪器厂）、X光机（Siemens公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组

建立大鼠股骨闭合性骨折模型[4]:麻醉满意后，常规右下肢备皮。取右下肢髌骨内缘约1 cm纵行切口，逐步显露髌骨并向外侧脱位，于暴露的股骨髁间凹中心插入1枚20号注射针头，沿髓腔至股骨大粗隆部穿出，再将针头更换为直径1.2 mm克氏针。取大粗隆处小切口显露穿出的克氏针，将其折弯紧贴大粗隆骨皮质，缝合切口。贴骨面剪断股骨髁间凹处克氏针，缝合切口。再将大鼠右下肢固定于造模支架上，钝骨刀轻压于大腿中部，用500 g的重物于20 cm高处沿轨道自由落体撞击，致股骨中段闭合性骨折。

选取钝骨刀撞击处无表皮裂伤的大鼠拍摄右股骨正侧位X线片，其中短斜行或横行股骨干骨折大鼠为造模成功大鼠，共42只。将造模成功的大鼠标记后采用随机数表法分为对照组和实验组，各21只。

1.2.2 给药

实验组大鼠给予Gefitinib 100 mg/（kg d）（溶于0.5%甲基纤维素）灌胃，对照组给予等量0.5%甲基纤维素灌胃。共持续1周。

1.2.3 骨内、外膜来源SCs的分离、提取及培养

由于骨折1周后开始逐渐形成骨痂[5-6]，因此笔者于造模1周后处死大鼠并置于75%乙醇中消毒15 min。在无菌环境下提取右股骨，-MEM清洗后缓缓刮下骨外膜，用蛋白酶溶液（PBS+2 mg/mL胶原酶A+25 mg/mL胰蛋白酶）消化2 h，获得骨外膜SCs的细胞悬液;用蛋白酶溶液消化股骨20 min，以彻底清除骨外膜SCs，随后去除生长板两端骨质，将股骨沿纵轴切开，去除骨髓后用蛋白酶溶液消化2 h，获得骨内膜SCs的细胞悬液。将上述所得的细胞悬液低速离心10 min后弃去上清液，保留细胞沉淀，再分别接种后置于37℃、5%CO2的饱和湿度恒温孵箱中培养。24 h后换液并加入培养基（-MEM+20%FBS+55 M-巯基乙醇+2 mM谷氨酰胺+100 IU/mL青霉素+100 g/mL链霉素），再置于孵箱中培养。每2 d更换培养基，每3 d换液。当细胞贴壁融合达90%时，再按1∶2传代。

1.2.4 骨内、外膜来源SCs表面标志物鉴定

取第3代骨内、外膜SCs，胰酶消化后计数。配制含0.5%BSA的PBS，各EP管中加入1 mL上述PBS及1×106个细胞;离心5 min后再用上述PBS清洗。然后每管100 L细胞悬液分别添加1 L抗体FITC-CD29、FITC-CD34、FITCCD45、FITC-CD90，4℃孵育30 min。再次离心后用上述PBS清洗并重悬，流式细胞仪检测分析。

1.2.5 骨内、外膜来源SCs增殖能力检测

取第3代骨内、外膜SCs，胰酶消化。再于6孔板中每孔加1 mL细胞悬液，密度为5×105/mL，37℃培养过夜。然后每孔加入BrdU调整浓度至30 M，孵育60 min。吸去培养基并收集细胞，重悬、离心、洗涤后每管加入500 L固定液，4℃固定过夜。洗涤、离心并每管加入500 L通透液重悬细胞，冰上孵育2 min，再次洗涤、离心。每管加入300 L含50 L变性剂的DNA变性工作液，再次洗涤、离心。用195 L染色缓冲液重悬细胞并每管加入FITCBrdU抗体5 L（0.125 g），4℃避光孵育30 min。用流式细胞仪进行检测。

1.2.6 骨内、外膜来源SCs多向分化能力检测

取第3代骨内、外膜SCs，接种于成骨培养基（-MEM+10%FBS+10 mmol/L-甘油磷酸钠+50 mg/L维生素C+0.1 mol/L地塞米松）及成软骨培养基（-MEM+10%FBS+0.1 mol/L地塞米松+50 g/mL L-抗坏血酸+40 g/mL L-脯氨酸+100 g/mL丙酮酸钠+1×ITS+10 ng/mL TGF-3）。成骨诱导21 d后行von Kossa染色，成软骨诱导21 d后行阿尔新蓝染色。在显微镜下进行观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本检验。<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨内、外膜来源SCs表面标志物鉴定

流式细胞仪测得FITC-CD29、FITC-CD34、FITC-CD45、FITC-CD90在实验组与对照组的骨内、外膜SCs中表达相似，即CD29、CD90呈现高表达，CD34、CD45呈现低表达（见表1）。

表1 细胞表面标志物的表达率（%，n=21）

表1 细胞表面标志物的表达率（%，n=21）

?

2.2 骨内、外膜来源SCs增殖能力检测

BrdU法检测各组荧光信号倍增量发现，骨内、外膜SCs的实验组荧光信号倍增量均显著低于对照组（<0.01）（见表2）。Gefitinib抑制EGFR信号通路后，对骨内膜SCs增殖抑制率为15.88%，对骨外膜SCs增殖抑制率为10.09%，可见骨内膜SCs增殖活动被抑制更明显。

表2 骨内、外膜SCs荧光信号倍增量的比较（%，n=21）

表2 骨内、外膜SCs荧光信号倍增量的比较（%，n=21）

?

2.3 骨内、外膜来源SCs多向分化能力检测

骨内、外膜SCs经成骨诱导分化、成软骨诱导分化21 d后，进行相应染色可见:von Kossa染色者镜下骨外膜SCs形成的矿化结节较骨内膜SCs形成明显;阿尔新蓝染色者镜下骨外膜SCs细胞内的淡蓝色颗粒较骨内膜SCs细胞内明显（见图1、图2）。

图1 成骨诱导后von Kossa染色结果（×200）:A.骨外膜SCs实验组;B.骨内膜SCs实验组;C.骨外膜SCs对照组;D.骨内膜SCs对照组

图2 成软骨诱导后阿尔新蓝染色结果（×100）:A.骨外膜SCs实验组;B.骨内膜SCs实验组;C.骨外膜SCs对照组;D.骨内膜SCs对照组

3 讨论

骨作为一个长期处于高度动态平衡的组织，一旦出现破损，能激发巨大的再生潜能，以重建其完整性及运动功能[7]。骨折愈合主要通过两种方式:一期愈合与二期愈合。一期愈合是指断端复位并处于绝对稳定的情况下，经哈弗系统重建直接发生接触式愈合，无明显骨皮质区吸收、无明显外骨痂生成;二期愈合则在临床上最为多见，包括膜内化骨与软骨内化骨两种形式，有骨痂生成[5,8]。膜内化骨发生在愈合早期骨折近、远端表面，骨内、外膜中的SCs分化为成骨细胞并合成、分泌新的骨基质，骨基质逐渐钙化后形成内、外骨痂，起到一个支架的作用，为断端愈合提供亟需的稳定环境[9-12]。软骨内化骨则发生在骨折端中央，SCs分化为软骨细胞后合成分泌软骨基质，将断端的纤维组织转变为软骨组织，随后破软骨细胞和成骨细胞伴随毛细血管侵入软骨组织，使软骨钙化形成环状骨痂和髓腔内骨痂，连接骨折两端恢复连续性，起到骨桥的作用[9,13]。由此可见，骨膜来源SCs在骨折愈合中的核心程度。

EGFR信号通路近些年来逐渐被学者们解密，发现其是机体调节骨代谢的重要途径[14]。EGFR作为一种跨膜糖蛋白包括3个部分——胞外能与配体相结合的结构域、疏水性的跨膜结构域、细胞内的催化酪氨酸激酶结构域和酪氨酸残基[15-16]。它在特异性配体刺激后形成一种二聚体，在细胞内发生磷酸化后激活下游接收者，从而达到调控细胞核内相关基因表达的目的，以影响细胞的增殖、分化、凋亡行为[13,17]。目前，已有许多研究证实了EGFR信号通路在骨折愈合过程中的关键作用。例如，Yang等[18]研究发现，miR-96可阻断EGFR信号通路来促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化;Zhu等[19]研究发现，EGFR激活后抑制成骨细胞核内Runx2和Osterix基因的表达，进而抑制了成骨细胞的分化与矿化;Saito等[20]研究发现，EGFR活化后能够增加成骨细胞的数量;Chandra等[21]通过增加早期生长反应2（early growth response，EGR2）的表达促进成骨细胞的增殖和存活。但研究者们尚未深究EGFR信号通路—骨膜干细胞这一中间过程。同样，本课题组通过前期实验发现EGFR信号通路被抑制后能显著加快大鼠股骨中段骨折的愈合进程[3,22]，其中的具体机制需进一步研究。

因此，本次实验使用Gefitinib抑制EGFR信号通路后检测骨内、外膜来源SCs增殖能力，成骨、成软骨分化能力来探索在骨折愈合早期EGFR信号通路与此类SCs之间的关联。首先，笔者对提取的骨内、外膜SCs进行细胞表面标志物鉴定，发现FITC-CD29、FITC-CD90呈高表达，FITC-CD34、FITC-CD45呈低表达，这与Asumda等[23]的研究结果相吻合:成骨相关的干细胞高表达表面抗原CD29、CD90，低表达内皮细胞表面抗原CD45以及造血干细胞表面抗原CD34。其后，笔者通过BrdU掺入法检测干细胞增殖能力，发现在骨折愈合早期骨外膜SCs的增殖力较骨内膜SCs更强，同Gastel等[24]的结果类似，这可能与骨内膜血供相对外膜偏少有关。在EGFR信号通路被抑制后，骨内、外膜SCs的增殖力显著被抑制，且骨内膜SCs受抑制更明显，这可能与影响了细胞周期抑制因子相关基因（P15、P16、P21、P27）的表达有关，需要后期深入探究。最后，笔者对SCs行成骨诱导分化21 d并染色后，发现实验组SCs的矿化结节较对照组更多;同样，经21 d成软骨诱导分化并染色后，发现实验组SCs的淡蓝色颗粒较对照组更多，表明通过Gefitinib抑制EGFR信号通路后，骨内、外膜SCs的成骨、成软骨分化能力增强。结合之前学者的研究，猜测抑制EGFR信号通路将抑制骨髓间充质干细胞、骨膜干细胞、成骨细胞、成软骨细胞这一系列与骨折愈合密切相关细胞的增殖过程，但促进它们的分化过程，这有待进一步探索。

目前，骨折愈合的分子机制尚未被研究透彻，本研究将为学者们对其机制及EGFR信号通路的探索提供宝贵经验，也将为EGFR信号通路成为促进骨折愈合新的治疗靶点提供更多理论基础。