真菌致龋机制的研究进展

2020-12-19张璐瑾商庆龙

口腔医学 2020年10期

张璐瑾，商庆龙

在人类口腔中存在着由700多种微生物构成的复杂生态系统，这个生态系统包括大量细菌和少量真菌[1]，儿童和健康成年人口腔真菌分别有46种和101种[2-3]。目前认为龋齿发生与口腔微生物群落组成和相对丰度的变化有关[4]。细菌致龋的研究较多，包括生物膜、细菌间协同致龋等，而口腔真菌致龋的研究较少，真菌在龋病发生过程中的作用尚不清楚，本文就真菌致龋的相关研究进展作一综述。

1 核心口腔真菌

由于部分真菌无法培养，不同真菌个体间存在巨大的差异，真菌数据库不完善，近年来在真菌致龋研究中引入了“核心口腔真菌”的概念[5]。“核心口腔真菌”是指在超过20%的抽样样本中普遍存在的口腔真菌群的核心成分，目前包括了假丝酵母菌属、枝孢属、曲霉菌属、镰胞菌属、链格孢菌属、隐球菌属和短梗霉菌属等被公认的7种真菌[3,6-7]。其中，假丝酵母菌属是目前主要的研究对象，但是假丝酵母菌属与龋病的关系尚不清楚。核心真菌群在龋病中所发挥的作用也有待阐明。

2 经典的致龋机制研究

2.1 龋病

龋病是细菌等因素引起的慢性、进行性牙齿硬组织破坏的疾病[8]。在龋病发生过程中，糖类助长了相关病原体增殖，致使生物膜微环境酸化，使牙齿硬组织脱矿，并破坏有机质，导致龋齿[9]。在临床上，龋病可进展至牙髓炎、牙周感染等。龋病的影响因素还包括宿主易感性、环境因素、教育和社会经济状况等[10-11]。龋病治疗包括了致龋菌抑制、脱矿抑制与再矿化[12]。

2.2 细菌致龋的支持证据

在龋齿中分离到的多种口腔细菌被作为龋病潜在的病原体，其中，变异链球菌、粪肠球菌、远缘链球菌和唾液链球菌等参与了生物膜形成[13]，粘附在牙体硬组织表面并使局部酸化[14]。龋病没有特定的病原体，如变异链球菌是龋齿发生与发展的潜在参与者[15]，但变异链球菌不存在时，韦格斯卡多维亚菌也与幼儿龋病的发生发展有关[16]。

2.3 致龋研究中遇到的问题

首先，单独抗细菌治疗无法治愈龋病[17]。常规龋病的抗细菌治疗使口腔龋病相关细菌数量减少，但病灶中却残留大量真菌如假丝酵母菌，辅以抗真菌药物有助于龋病治疗[18]。其次，部分乳杆菌有抑制龋齿作用。格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌等乳杆菌属细菌能够抑制致龋病原体生存、生长和增殖[19]，通过聚集形成屏障，抑制病原菌的粘附作用[20]。乳酸菌属产生的细菌素及生物表面活性剂和丁酸钠等代谢物能抑制假丝酵母菌菌群，副干酪乳杆菌能通过调控关键基因TEC1和UME6显著下调白假丝酵母菌菌丝形成[19-21]。随着研究的深入，细菌之外的病原体作用也受到了关注。

3 真菌致龋的研究

3.1 真菌通过产酸致龋

3.1.1 部分真菌具有较高产酸性及耐酸性白假丝酵母菌合并高糖饮食可引起龋病[2]。白假丝酵母菌能产生乳酸和其他有机酸[22]。假丝酵母菌通过溶解羟基磷灰石引起牙釉质脱矿[23]，这种溶解能力高于变异链球菌[2]。另一方面，细胞膜H+-ATPase使白假丝酵母菌具有极高抗酸性[24]，与对照组相比，患龋病例中分离的白假丝酵母菌菌株的基因型不同，抗酸性更强[25]。

3.1.2 真菌增加多物种混合生物膜酸性高水平蔗糖增强了假丝酵母菌与龋病相关细菌之间的相互作用以及与牙体的物理粘附性，细胞外间质产量和微生物生物量，促进了生物膜形成。白假丝酵母菌的存在增加了白假丝酵母菌-变异链球菌混合生物膜的酸性[22,26]，也使白假丝酵母菌-粘性放线菌混合生物膜pH值明显下降[22]。

3.2 真菌通过参与生物膜形成致龋

3.2.1 真菌参与生物膜结构真菌在龋坏部位可以单独存在，还可以与细菌形成混合小菌落，以生物膜形式参与致龋过程，生物膜内的假丝酵母属对多种抗真菌药物的敏感性比游离真菌低1 000倍[19]。白假丝酵母菌和都柏林假丝酵母菌是咬合面和牙根表面龋病病变部分生物膜的重要组分。结构分为两种形式：一种是由假丝酵母菌菌丝网络混合大量丝状细菌、球菌和棒状细菌组成了贯穿整个生物膜的区域，另一种是假丝酵母菌与链球菌在生物膜表层形成了玉米棒样的构型，这些链球菌包括了格氏链球菌和口腔链球菌等小群体链球菌种(mitis group streptococci，MGS)[27]。

3.2.2 真菌增促进生物膜增长 ①粘附性增加，口腔真菌与细菌的混合感染主要通过增加细菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)产量，以增强微生物之间、微生物与牙面之间的粘附性，促进体外生物膜形成。真菌产生EPS，受链球菌属胞外酶—葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)诱导分泌，受体为白假丝酵母菌表面甘露聚糖分子。白假丝酵母菌-变异链球菌混合生物膜中，EPS总量高于单物种生物膜，白假丝酵母菌细胞被EPS包被，粘附性增加[28]。白假丝酵母菌在人类唾液中粘附性大幅增加。其分子机制是口腔唾液中富含脯氨酸的蛋白质附着于细菌，为真菌粘附提供额外受体[28]。② 生物量增加，白假丝酵母菌与变异链球菌等龋病相关细菌的混合生物膜生物量高于任何单菌种生物膜[26]。分子水平上，白假丝酵母菌与变异链球菌共同感染时，变异链球菌抗原Ⅰ/Ⅱ与其对应的受体为凝集素样序列基因(agglutinin-like sequence，ALS)编码的粘附蛋白是细菌定植需要的。在蔗糖存在环境中，抗原Ⅰ/Ⅱ也促进白假丝酵母菌定植，并提高了其致病性[29]。格氏链球菌细胞壁蛋白SspB与白假丝酵母菌表面凝集素样序列基因3(agglutinin-like sequence 3，ALS3)的N端结合能促进共感染，提高了混合生物膜的生物量[30]。③假丝酵母菌菌丝形成，白假丝酵母菌-口腔链球菌生物膜通过增强菌丝生长基因(enhanced filamentous growth 1，Efg1)成丝途径促进白假丝酵母菌菌丝形成，Efg1调节的粘附素ALS1是这种混合生物膜的关键介质。Efg1的缺失不影响白假丝酵母菌-变异链球菌混合生物膜中真菌细胞的数量，可能因为葡糖基转移酶B(glucosyltransferase B，GtfB)通过Bcr1独立机制促进白假丝酵母菌-变异链球菌生物膜形成[26]。

3.3 真菌通过与细菌协同致龋

3.3.1 真菌-细菌协同作用间接影响龋病发生发展在口腔，真菌与细菌以及宿主之间在物理、化学和代谢方面建立了紧密的生态关系[31]。口腔真菌促进了细菌粘附、增殖和侵袭，而细菌也影响了真菌的增殖、发展和侵袭[32]，两者的协同作用间接地影响了龋病的发生发展。一方面，真菌和细菌的协同促进了对糖类的分解，代谢产物为真菌和细菌的生存与增殖提供能量，双物种生物膜的密度增大，比单物种生物膜形成了更多的微生物菌落，EPS的产量和附着力也明显提高[22]。细菌胞外多糖结合在真菌细胞表面，发挥了合成葡聚糖的功能[21]，使白假丝酵母菌成为物理支架拓展胞外多糖的粘附作用。另一方面，某些真菌与细菌互相提供新的粘附位点。假丝酵母菌通过与早期定植菌(如链球菌属和放线菌属)结合在牙齿定植[33]。

3.3.2 真菌-细菌协同致龋的分子机制 ①真菌-细菌的细胞壁表面蛋白质/受体相互作用：白假丝酵母菌与MGS有特定的细胞壁表面蛋白质/受体，其相互作用受白假丝酵母菌细胞壁ALS和HWP1粘附素介导，这些结合也可能涉及到SspA、SspB、ALS1、ALS3、ALS5、O-甘露糖基残基、天冬氨酸蛋白酶Sap9等[26,28]。②真菌-细菌的QS系统相互作用：链球菌属与白假丝酵母菌具有一种依赖于自动诱导、细胞密度分子依赖性的毒力特异性，称为群体感应(quorum sensing，QS)[34]。链球菌属的QS分子影响白假丝酵母菌的毒力：链球菌属QS分子包括自体诱导信号分子-2(autoinducer-2，AI-2)、肽聚糖片段、外源酶和过氧化氢(H2O2)和法尼醇等[26]。与对照组相比，AI-2缺失的链球菌属与白假丝酵母菌的混合生物膜中，白假丝酵母菌菌丝减少30%，AI-2以及其他信号分子能加强菌丝形成[28]。格氏链球菌的营养副产物以及H2O2刺激生物膜内白假丝酵母菌菌丝的发育，口腔链球菌激活真菌天冬蛋白酶的表达[26]。白假丝酵母菌激活变异链球菌QS系统：白假丝酵母菌通过法尼醇等QS分子，激活变异链球菌的毒力基因和GtfB的生产，并通过提供生长刺激因子和降低氧紧张促进链球菌增殖[28]。

4 真菌致龋研究中需要解决的问题

4.1 关注部分真菌具有抑龋作用

真菌产生的抑制因子能抑制细菌生物膜形成，为真菌提供了竞争优势。出芽短梗霉菌产生的多元醇酯(liamocins)能杀灭或抑制变异链球菌和远缘链球菌，抑制细菌粘附、生物膜形成及牙菌斑的发展，并随着时间推移去除生物膜，从而抑制龋病，在这个过程中，不会破坏口腔正常的微生物[35]。这一类真菌的作用机制仍需深入研究，以用于预防和治疗龋病。

4.2 推进真菌-细菌相互作用的研究

真菌-细菌之间的协同或抑制作用的机制仍需要深入研究，尤其在产酸、生物膜、生物学特性和致病机制等方面的研究。采用多学科合作研究的模式，推进真菌-细菌相关研究。采取活细胞成像技术，动态反映牙菌斑群落致龋过程；使用基于代谢组学的功能分析、群体感应分析和转录谱上调或下调基因的鉴定以进一步研究真菌-细菌相互作用。

4.3 需要加强口腔真菌菌群的研究

一方面，需要增加对致龋真菌群体的细分研究，区分致龋和抑龋类真菌。在龋病病程中，口腔微生物组成与结构发生了改变[36]，需要对患龋时口腔真菌菌群的作用进行深入研究。选取口腔真菌进行全基因组测序，建立龋齿相关的口腔真菌数据库。另一方面，加强口腔核心真菌菌群的研究，按照菌群类型细分的原则，深入研究致病性真菌的生物学和致龋机制，并对细菌与真菌在致龋与抑龋中的协同与抑制机制深入研究，揭示真菌致龋的机制。