家畜黄体新生血管形成的分子机制及其意义

2020-12-18张正红刘召远张经伟王正朝

家畜生态学报 2020年3期

张正红，刘召远，张经伟，王正朝

(福建师范大学生命科学学院福建省发育与神经生物学重点实验室，福建福州 350007)

在哺乳动物中，黄体的主要作用是产生大量的孕酮，对妊娠的建立和维持是必不可少的。在黄体的形成和发育过程中，新生血管的形成起到了关键性作用，对黄体功能的维持具有重要的作用[1-2]。在灵长类动物中，通过靶向抗体或可溶性血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)受体抑制黄体VEGF，则阻断血管形成与孕酮产生[3-4]。同样在奶牛中，中和VEGF或碱性成纤维细胞生长因子-2(Fibroblast Growth Factor-2，FGF-2)也可以抑制黄体的发育和孕酮的产生[1-3]。另外，黄体血管形成在黄体功能中的重要作用已经通过转基因、基因敲除和基因敲入小鼠模型得以证明，并发现血浆孕酮水平的降低与黄体血管化中断和生育能力的降低密切相关，进一步表明了黄体血管形成与黄体功能相关[1-4]。黄体的形成是一个复杂的生理过程，在相对较短的时间内发生了一系列完整的生物学事件，具有重要的生理学意义[1-7]。如牛黄体在10 d内细胞体积增加了60～100倍，其生长速率可与生长最快的肿瘤相媲美，黄体组织重塑完全依赖于强烈的血管增生和新生血管的形成[5-7]。

1 家畜黄体新生血管形成的启动

1.1 排卵前卵泡的编程作用

黄体发育的结构和功能框架是由排卵前卵泡提供的，这产生了黄体功能的卵泡编程作用的概念。目前，对卵泡血管化在这个编程作用中的功能还知之甚少，但卵泡内膜层的血管化程度可能决定了随后黄体血管化程度；同时也提出在卵泡向黄体转变过程中内皮细胞形成“血管起始点”，这些起始点在血管床重建过程中为内皮细胞迁移和增殖建立支架[1-7]。

排卵前卵泡在黄体血管生成中的另一个可能作用是在卵泡发生过程中各种促血管生成因子的累积作用，如卵泡液中FGF-2浓度达到1 ng/mL和VEGF浓度达到2～5 ng/mL[5-7]。这些因子可能通过其肝素结合性在卵泡基膜中被隔离，并随LH峰诱导蛋白酶激活[5-7]。人卵泡液可剂量依赖性地促进人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)细胞的增殖[8]。热失活或免疫中和FGF2/VEGF不能阻断这种刺激作用。进一步研究发现卵泡液诱导血管增生是通过1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-Phosphate，S1P)[9]。溶血磷脂酸(Lysobisphosphatidic Acids，LPA)是另一种磷脂，是由颗粒细胞产生并在卵泡液有着更大的浓度(25 μM)[9]。另外，10 μM LPA处理的培养基可通过IL-6和IL-8促进HUVEC细胞迁移、渗透和增殖[8]；同时还证明了LPA可以增加牛主动脉内皮细胞的增殖以及黄体细胞孕酮的产生[9]。

1.2 LH峰的启动作用

促黄体生成素(Luteinizing Hormone，LH)峰及其刺激排卵过程对大量基因的表达上调是至关重要的，其中许多基因与调控血管增生有关。事实上，内源性LH峰的大小与发育黄体的血管化程度呈正相关，认为LH峰有黄体血管增生的启动作用[10-12]。例如，牛LH峰后不久卵泡FGF2 mRNA和蛋白浓度急剧增加，而VEGF的表达似乎不受LH峰的影响[5-7]。目前，尚不清楚LH峰对其他物种黄体化颗粒细胞中VEGF表达的确切影响。新一代测序技术的发展就LH峰对卵泡转录组的影响作出了更详细的分析，结果发现许多血管增生相关的基因表达都受LH峰调控，确认了一些已知的刺激血管增生过程或内皮细胞功能的因子(如FGF2、纤连蛋白和肌配蛋白B2)，同时发现与组织重建相关的一些基因也影响血管增生(如酸性半胱氨酸蛋白和转化生长因子-1)。值得关注的是，一些被认为是抗血管增生的因子也被上调了，如穿透素3、轴突导向因子3A/C和血小板反应蛋白1。排卵需要前列腺素(Prostaglandin，PG)，且环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂可以抑制排卵[5-7]。在颗粒细胞中，LH促进PG合成，排卵前达到峰值，PGE2已经证明至少在灵长类动物中是重要的前列腺素[11-12]。越来越多的证据表明PGE2不仅对排卵至关重要，而且也是黄体血管增生的重要刺激因子。Sakurai等人研究发现COX-2抑制剂NS-398处理大鼠可以抑制早期黄体的血管形成，并减少孕酮的产生，而联合使用PGE2可以逆转这一效应[13]。

2 促血管生成因子对黄体新生血管形成的调控

2.1 FGF2和VEGF

FGF2和VEGF是最重要的促血管生成因子，是最有力的细胞分裂剂，也可促进内皮细胞的迁移和生存。VEGF在奶牛和人的发育黄体中主要定位于类固醇细胞，抑制VEGF作用将显著降低灵长类动物黄体的血管化和孕酮的生成[5-7,10-12]。有趣的是，FGF2在早期黄体中水平非常高，几天后就会恢复到基础水平，同时FGF2蛋白也从内皮细胞转移到类固醇细胞，然后再返回[14]，表明FGF2在黄体血管生成过程中具有动力学的作用。内皮细胞涌出的关键过程是在已建立的脉管系统内形成一种特殊的内皮端细胞，因此，FGFR信号可能对内皮端细胞形成和血管形成至关重要。血管通透性的调节是内皮细胞的一个重要功能，它对黄体组织的营养/激素的供给非常重要。VEGF是内皮细胞通透性的有效刺激因子，是由粘附分子(如VE-钙粘蛋白)和紧密连接(如闭合蛋白)所调控。Herr等研究发现hCG可以诱导VEGF依赖性VE-钙粘蛋白和闭合蛋白5表达下调，这与人颗粒-内皮共培养系统的内皮细胞通透性增加有关[15-16]。

2.2 白介素-8(IL-8)

IL-8是一种嗜中性粒细胞特异性的趋化因子和促血管生成细胞因子，在早期黄体中高度表达，与多核中性粒细胞(Polymorphonuclear Neutrophils，PMNs)的丰度一致。此外，培养早期黄体细胞的条件性培养基可以促进体外培养的PMN细胞迁移，且可以被IL-8抗体阻断。重组牛IL-8和PMN上清可以促进黄体内皮细胞增殖和血管形成[17-19]。

2.3 酸性半胱氨酸蛋白(SPARC)

SPARC是一种基质相关糖蛋白，调节细胞的分化、迁移和细胞间的信息传递。重要的是，SPARC的功能通过靶向蛋白水解而发生变化，成熟的SPARC蛋白是抗血管生成因子，其水解片段是促血管生成因子[20]。转录组分析发现hCG诱导小鼠颗粒细胞中SPARC mRNA上调7倍。TGF-β和纤维粘连蛋白剂量依赖性诱导牛黄体化颗粒细胞中SPARC的表达。此外，SPARC蛋白主要在黄体细胞和内皮细胞中表达，且SPARC水解片段可以增加内皮细胞网的形成，还可以促进孕酮的产生[20]。因此，SPARC或含KGHK肽可能是治疗黄体功能不足的新靶点。

2.4 缺氧诱导因子-1(HIF-1)

在肿瘤发生过程中，血管生成的关键动力是低氧诱导VEGF的表达上调。细胞缺氧激活HIF-1(Hypoxia Inducible Factor)，其与启动子HRE结合，启动缺氧调节基因的转录。HIF-1作为转录因子，是由氧调控的HIF-1 和结构表达HIF-1β组成的异二聚体[10-12]。在有腔卵泡发育的后期，卵泡液中的氧浓度下降[5-7]。在排卵后血管重构和早期黄体发育过程中，组织氧浓度降低，导致HIF-1a表达[10-12]。在猪、人类、奶牛和小鼠的排卵期时，HIF-1 均被上调。此外，棘毒素是HIF-1特异性抑制剂，可以阻断小鼠的排卵[21-22]。目前，前期的研究也已经表明HIF-1 可以通过调节VEGF的表达参与黄体血管生成和和早期黄体发育[5-7,10-12]。

2.5 Notch信号通路

Notch信号通路在内皮细胞顶端的形成中起着重要作用。膜结合的δ样配体4(DLL4，Delta-Like Ligand 4)在内皮端细胞中表达，并与邻近细胞Notch结合，转变为柄细胞[4]。DLL4和Notch1-4已经被检测到在小鼠黄体内皮细胞和类固醇细胞中表达。用γ-分泌酶抑制剂处理，阻断下游Notch信号通路，小鼠将发生排卵前卵泡发育障碍，这可能与内皮细胞紊乱和血管平滑肌细胞密度增加的内膜层相关。此外，血浆雌二醇的浓度几乎降低了三倍[4]。内皮细胞模式与高浓度FGF2诱导牛黄体细胞的结果相似，且用γ-分泌酶抑制剂处理可降低大鼠孕酮浓度[4,14]，表明FGF2、VEGF和Notch通路之间在早期黄体发育过程中可能存在着潜在的相互作用。

3 抗血管生成因子对黄体新生血管形成的调控

3.1 血小板反应蛋白(THBS)

THBS-1和THBS-2是一些细胞类型分泌的大分子糖蛋白，可以与结合细胞外基质(ECM，Extracellular Matrix)结合。THBS通过其受体CD36(Cluster of Differentiation 36，分化簇36)调控内皮细胞功能，如迁移、粘附和细胞凋亡。THBS-1、THBS-2和CD36在大鼠早期黄体中表达最多，FGF2和THBS-1对体外培养的牛黄体内皮细胞有相反的作用[23-24]。此外，THBS-1可以阻碍FGF2诱导黄体内皮细胞迁移和增殖，这与血小板反应蛋白模拟肽ABT898对绒猴卵泡血管生成影响体外观察结果是一致的，但ABT898对排卵和血浆孕酮浓度没有影响[23-24]。

3.2 8b亚型VEGF

VEGF外显子8可以通过不同的剪接，产生两种VEGF亚型，即8a和8b。8a亚型家族具有典型的促血管生成作用，而8b亚型家族则具有抗血管生成作用[25]。这种复杂性目前还了解相当缺乏，且绝大多数VEGF抗体不能区分这两种不同亚型家族。8b亚型VEGF通常与8a亚型VEGF一起表达，但在绵羊黄体中8a亚型VEGF表达升高，却没有检测到8b亚型VEGF。有趣的是，过表达8b亚型VEGF可以减少生育率、黄体数和黄体血管化程度[25]，进一步表明在黄体发育过程中促血管生长因子和抗血管生成生长因子之间平衡的重要性。

3.3 血管抑制蛋白-1(VASH-1)

VASH-1与IGFBP-7(Insulin-like Growth Factor Binding Protein-7，胰岛素样生长因子结合蛋白-7)是另外两个血管生成的负调节因子。在牛黄体发育过程中，VASH-1在黄体内皮细胞中持续表达，且通过VEGF上调[26]。VASH-1抑制VEGF诱导牛黄体内皮细胞管的形成[26]，表明其可以防止血管生成的过度刺激。IGFBP-7可调节细胞增殖、粘附和血管生成，且在大鼠卵泡液和黄体中已经检测到其表达[27]，IGFBP-7可以减少VEGF和LH诱导黄体内皮细胞管的形成[27]。

3.4 穿透素3(PTX-3)

PTX-3是一种分子量为45 kDa的糖基化蛋白，是由内皮细胞和激活的吞噬细胞产生。PTX-3与FGF-2的亲和力高，可阻止FGF-2与FGFR结合，阻断其促血管生成作用[28]。另外，在使用PGF2 后，PTX-3在成熟黄体中的表达显著增加，表明PTX-3在黄体溶解中具有抗血管生成功能[28]。

4 其他因子对黄体新生血管形成的调控

4.1 血管内皮钙黏蛋白(VECD)

VECD是一种内皮细胞特异性分子，可在相邻细胞间形成粘附连接，不仅能维持血管完整性，而且还能调节内皮细胞增殖、凋亡和VEGFR功能[29]。在血管增生过程中，Notch/VEGFR信号通路可以改变VECD连接，驱动内皮细胞重新排列[4]。利用E4G10抗体免疫中和小鼠VECD能降低黄体发育、血管化程度和血浆孕酮浓度[29]，进一步表明VECD对黄体血管生成的至关重要性。TGF- 处理牛黄体内皮细胞，导致细胞连接处VECD丢失，减少细胞接触，增加内皮细胞渗透性[29]。相反，FGF2信号可以促进VECD的表达和维持血管的完整性[29]。

4.2 内皮下祖细胞(PCs)

PCs与内皮细胞形成亲密接触，是微血管的组成部分。通常认为PCs通过稳定新形成的内皮管，参与后期血管生成[30]。诱导PDGFR-B(Platelet-Derived Growth Factor Receptor，血小板衍生生长因子受体-B)的表达可以刺激PCs，促进内皮细胞募集。事实上，阻断卵巢内PDGFR将减少黄体的数量和孕酮的产生，同时减少微血管的内皮细胞和PCs[30]。在发育黄体中，PCs数量丰富，并形成大量增殖细胞，支持强烈的黄体血管生成。

4.3 胰岛素样生长因子-1(IGF-1)

IGF-1是一种内分泌和旁分泌生长因子，在调节卵泡和黄体功能方面具有重要作用。IGF-1在黄体中局部表达，且对孕酮的分泌有刺激作用，被认为在血管增生过程中具有促血管生成的特性[30]。另外，IGF-1还可以通过稳定血管内皮细胞和新生血管来促进血管生成，这对黄体血管生成特别重要，因为最初在内膜层的黄体血管化不稳定[31]。目前，有关IGF-1在调节卵巢血管生成方面的作用仍知之甚少，有待进一步深入研究。

5 临床意义

5.1 卵巢癌

肿瘤的生长和最终的转移需要活跃的血管增生，由促血管生成因子的上调和内源性抑制因子的下调导致，为治疗干预提供了许多机会。晚期上皮型卵巢癌与血清VEGF水平升高有关[32]，而VEGF是迄今为止的主要治疗靶点，使用多血管激酶抑制剂在多水平上靶向肿瘤血管生成将成为下一步目标，如联合抑制VEGF，FGF和PDGF信号[32]。另外，还在探索如何利用内源性抑制血管生成，如改变血管形态、促进药物摄取和增加凋亡细胞死亡等。

5.2 卵巢过度刺激综合征(OHSS)

OHSS是在刺激卵巢治疗生育过程中的一种罕见但可能危及生命的并发症，其通常发生在黄体期或早期妊娠阶段，特点是卵巢分泌的血管活性肽(如VEGF)引起血管壁通透性的系统性增加[33-35]。OHSS与黄体和卵泡液体中VEGF表达和生物药效升高有关，VEGF可以促进血管通透性升高[33-35]。尽管VEGF在调节OHSS中具有重要的作用，但直接靶向VEGF将产生不良的副作用，故大多数预防性治疗都是靶向自身制定刺激方案，如减少LH的持续时间[33-35]。减少OHSS的发病率和严重性的另一种普遍关注的临床策略是激动剂多巴胺作为VEGF抑制剂的使用[33]。高危女性使用多巴胺可以降低OHSS的发病率，且对辅助生殖后的着床或妊娠结果没有不利影响[33]。