InDel标记在畜禽育种中的应用现状分析

孙珂欣，郭应威，曹 睿，赵海东，孙秀柱

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

选种是动物育种工作的重要环节。多数情况下，人们利用动物的生长性状作为标记、结合传统育种方法进行选种。资料显示，猪繁殖力每年的选择反应仅为平均产仔数的0.06%[1]，采用传统育种方法很难对其做出改良。随着分子生物学的发展，插入/缺失(Insertion/Deletion，InDel)分子标记出现在人们的视野中。InDel突变是指在近源物种或者同一物种基因组同一位点上发生了长度在5～50 bp左右的插入或缺失的突变，而InDel标记则是根据InDel突变位点而设计的遗传标记。InDel具有以下优点：(1)分布广泛、密度大、突变率低：Mills等[2]证明，每7.2 kb就会出现一个InDel位点，而InDel的突变率约为10-8；(2)InDel标记易于分型：与复杂的SNP分型系统相比，InDel分型简单快捷，利用PCR以及电泳平台即可方便简洁地进行。这些优点使InDel成为了优秀的新一代分子标记，为家畜育种工作提供了新方法[3]。但InDel位点影响家畜性状的机理尚未研究透彻，还需要更加深入的探索，才能为动物育种工作提供更为可靠的依据。

1 InDel标记在家畜育种工作中的应用

1.1 InDel标记在牛育种工作中的应用

1.1.1 InDel标记在牛生长性状选育中的应用 配对框(PairedBox，PAX)基因家族的PAX7基因，其表达产物是强有力的生肌性诱导物，它的表达在正常的肌卫星细胞中是必要的，在宏观上影响着中枢神经系统和骨骼肌的发育。研究表明，对小鼠进行PAX7基因敲除，小鼠会出现肌肉畸形，而基因型为纯合缺失的小鼠的体型较正常小鼠明显更小。基于现有的PAX7基因相关研究成果，Xu等[4]研究发现，中国黄牛PAX7基因中具有一个10 bp的InDel位点，此位点的多态性与6月龄牛的体重、身高、体长、心脏周长和平均日增重等生长性状均具有极显著相关的关系；而对于12月龄牛，此位点与牛的体重、体长和心脏周长密切相关，同时，基因型呈Del-Del的个体在生长性状方面的表现明显优于Ins-Ins和Ins-Del基因型的个体。这一研究成果为改良中国黄牛的工作提供了一定的理论依据。

影响牛肉肉质的主要因素是肌间脂肪的沉积情况。而脂肪酸转位酶CD36广泛存在于骨骼肌，脂肪等多种组织细胞的细胞膜，此酶的表达与机体脂质代谢、肥胖等表型密切相关。2014年，张松[5]将秦川牛母牛的CD36基因与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1基因作为研究对象，检测两者的多态性，并与秦川牛的肉质性状、体尺性状做出关联分析。以期研究CD36基因和KEAP1基因对秦川牛生长性状的影响。研究结果显示，在CD36基因上存在一个编号为SV1的8 bp InDel位点，而单个SV1位点的多态性以及SV1与其他多态性位点的不同组合，都与肌内脂肪含量具有显著相关。经徐丽[6]对比西门塔尔牛与大连雪龙牛的同样影响脂肪沉积的SREBP1基因的84 bpInDel位点缺失频率与两群体的脂肪相关性状，证明SREBP1基因的第五内含子区84 bp插入缺失与大连雪龙牛的背膘厚具有显著相关。SREBP1基因可以促进细胞生成脂肪，而此84 bpInDel位点同时显著着影响棕榈油酸、硬脂酸含量、SFA和甘油三酯及C16脂肪酸不饱和指数。这些研究结果或可在改良中国黄牛性状，培育高质量肉牛的工作中发挥作用。

1.1.2 InDel标记在牛抗病性状选育种的应用 牛脑海绵状病(Bovine spongiform encephalopathy,BSE)是一类慢性致死性中枢神经系统变性病，最早在羊、猫身上被人们所发现。在疯牛病的致病机制中，朊蛋白(Prion Protein，PrP)的表达水平与BSE的易感性密切相关。PrP蛋白无需DNA或RNA的参与便可以自我复制，这种蛋白的异常变构使得其不能被蛋白酶K分解，从而在脑组织中沉积，引起神经细胞退行性病变[7]。控制PRP的PRNP基因中，与疯牛病易感性相关的基因多态主要包括位于PRNP基因启动子区域的23 bp InDel多态与位于内含子区域的12 bp InDel多态。2007年，Hasee等[8]的研究显示，当对具有相似等位基因和基因型的品种进行品种间比对时，23 bp InDel位点的多态性与BSE的易感性具有显著相关。另外，2015年，为研究水牛对疯牛病的不易感性状，青丽丽[9]对水牛中的朊病毒基因多态性进行了研究，发现在水牛的PRNP基因23-bp与12-bp的多态中，与疯牛病易感密切相关的缺失型等位基因出现频率非常低。这一结果解释了这两种非常相近的动物在对疯牛病易感性的差异。同时也为培育不易患病的黄牛品种、规避疯牛病传染发生做出了一定的指导。

1.2 InDel标记在羊育种工作中的应用

1.2.1 InDel标记在毛发性状选育种的应用 羊毛的质量与产量都是产毛性能的一部分，产毛量和质量又都与毛囊的数量与发育情况有关。羊皮肤毛囊中的细胞间粘附部分由桥粒蛋白介导，桥粒又由多种蛋白质组成，包括桥粒核心糖蛋白和桥粒蛋白。桥粒芯糖蛋白4(desmoglein 4，DSG4)的表达水平密切影响着哺乳动物毛囊生长和分化。Zhang等[10]确定了位于绵羊DSG4胞质结构域的甘氨酸InDel位点，此InDel位点与另外5个氨基酸取代位点共同形成了两种类型的DSG4。但这些DSG4多态性是否与羊中的羊毛性状相关还有待研究。

1.2.2 InDel标记在羊繁殖性状选育中的应用 在各种家畜的养殖工作与遗传育种工作中，改良家畜繁殖力都是提高生产力的直接途径。赖氨酸去甲基化酶6A(Lysine Demethylase 6A，KDM6A)是与繁殖力有关的候选基因，若敲除KDM6A基因，小鼠配子发育即受到限制，说明KDM6A与动物的繁殖密切相关。Cui等[11]锁定陕北白绒山羊KDM6A基因的mRNA表达谱以确定基因中的InDel变体，发现了一个16 bp的InDel位点和一个5 bp的InDel位点。其中，16 bp InDel位点呈插入/插入基因型的个体平均首胎产仔数高于缺失/缺失基因型个体，单羊羔母羊与多羊羔母羊的16 bp indel位点基因型也存在显著差异，证明此位点与山羊的第一胎产仔数相关，同时影响着山羊的多胎性状。

生长分化因子-9(Growth differentiation factor-9，GDF-9)基因是家畜高效增殖的候选基因，它参与着雌性动物生殖活动中的几种关键性颗粒细胞酶的调控。Wang等[12]在陕北白绒山羊和关中奶山羊的GFD-9基因上发现了一个新的12 bp的InDel位点，陕北白绒山羊群体中同时存在着插入/插入、插入/缺失、缺失/缺失的基因类型，而呈纯合基因型的母羊首胎产仔数明显大于杂合基因型的母羊，在后续的跟进分析中，单羔母羊与多羔母羊之间的基因型分布也存在着显著差异。

LIM同源框基因4(LIM Homeobox 4，LHX4)基因影响着动物的垂体发育与激素分泌，Yan等[13]在陕北白绒山羊的LHX4基因中发现了一个新的12 bp indel位点，并发现基因型在单羊羔和多羊羔母羊中的分布具有显著差异，表明该位点可能会影响山羊的产仔数量，可被选为山羊育种的遗传标记，为山羊的育种提供了一定的理论依据。

LIM同源框基因是同源框基因家族中的一员，其表达产物是LIM同源框转录因子，用以调控体内某些基因的表达，决定着组织和细胞的特异性分化，而LIM家族中的LHX3基因表达产物密切影响着动物的垂体早期发育以及垂体激素分泌过程[14]。Zhao等[15]研究证实了同羊等4个地方羊品种的LHX3内含子区内包含一个29 bp的indel位点，而高生育力品种与低生育力品种的此位点基因型具有显著差异，这表明羊生育力的高低与这个indel位点之间具有一定的相关性；同时，纯合的插入/插入基因型是最有利于同羊生长的基因型，这种基因型的个体生长性状明显优于杂合基因型的个体。

1.2.3 InDel标记在羊生长性状选育中的应用 生长激素(growth hormone，GH)是调节动物生长发育等代谢过程的一个重要内分泌因子。其与靶细胞膜表面的生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)的结合是GH在组织中发挥作用的第一步也是最重要的一步[16]。Yang等[17]研究了山羊的GHR基因，并发现了一个新的14 bp InDel位点。此位点的插入/插入型个体在身高、体长、胸宽、胸深、髋关节高度等性状上显著优于其他个体，同时，山羊中单羔和多羔的母羊之间基因型也存在着显著差异。数据关联分析显示，这个14 bp的InDel位点显著影响着山羊的体尺性状及首胎产仔数。

朊病毒蛋白基因表达不仅影响动物的海绵状脑病，同时也影响着反刍动物的表型性状。为研究PRNP基因多态性与羊的生长性状之间的关系，Li等[18]对中国与蒙古的五个羊品种的健康个体进行了鉴定分析。检测工作包含了三个位于内含子，一个位于3'UTR的InDel位点，这些InDel位点的多态性与13种不同的生长性状显著相关。其中位于内含子的15 bp InDel位点与小尾寒羊的胸宽具有极显著关联；位于3'UTR的7 bp InDel位点又极显著地影响着湖羊的胸围。以上研究对绵羊的育种工作具有一定的指导意义；而在山羊的研究工作方面，Lan等[19]发现了一个新的位于PRNP基因的28 bp indel位点，在内蒙古白绒山羊群体中，此位点的多态性显著影响着一岁龄羊的体重与三岁羊的羊毛厚度。同时，此位点多态性还与西农萨能羊的产奶量显著相关。这一发现可以帮助人们在进行山羊选育工作时选择较为优良的基因组合个体，从而达到快速提高生产力、改良现有品种的效果。

1.3 InDel标记在鸡育种工作中的应用

1.3.1 InDel标记在鸡生长性状选育中的应用 鸡的腹脂率对其胴体品质具有极大的影响，鸡腹脂率越低，则胴体品质越高。梁浩等[20]对肉鸡高、低腹脂双向选择品系第十九世代肉鸡为研究对象，在低脂系肉鸡基因组中挖掘出71个插入/缺失性RNA编辑位点，同时在挖掘出高脂系肉鸡基因组中的71个插入/缺失型RNA编辑位点。

Zhang等[21]鉴定了鸡的PAX7基因内一个新的31 bp InDel位点，发现此位点显著影响4、6、8、10、12周龄鸡的体重和体长指数，这些生长性包括胴体重、去内脏重、胸肌肌纤维直径等。这说明位于PAX7基因第3内含子中的31 bp InDel位点多态性与鸡生长、胴体、肉质性状相关，此位点的缺失类型会导致鸡的正常生长和胴体性状产生负面效果，但对鸡的肉质性状具有一定的积极影响。

磷脂酸磷酸水解酶基因，也称为磷脂酸磷酸水解酶(Lipid Phosphate Phosphohydrolase，LPIN)基因，这个基因家族在双向调控机体脂肪代谢的过程中发挥着重要作用。LPIN基因家族中的一员--LPIN1基因，其表达水平影响脂肪沉积，而不正常的不表达、过量表达均会引起脂肪沉积的剧烈变化[22]。Wang等[23]鉴定了鸡的LPIN1基因外显子及其侧翼区域，共检测到3个InDel位点，其中，6 bp InDel位点多态性与雏鸡的出壳重、2周龄体重均有显著影响；而3 bp InDel的位点多态性对4周龄、6周龄体重，盲肠长度等性状有显著影响；12 bp InDel位点多态性又显著影响着12周龄体重、胴体重、乳酸脱氢酶表达水平等性状。3 bp InDel位点与12 bp InDel位点的不同组合基因型也与鸡的腿部肌肉重量等生长性状之间具有显著相关。

饥饿激素(Ghrelin)是生长激素促分泌素受体的内源性配体，它具有调节调节食欲的作用，促进鸡的采食。鸡的Ghrelin基因中存在一个8 bp InDel位点，其多态性与鸡的28日龄体重、56日龄体重、腿肌重量、全净重等生长指标显著相关，呈现此indel位点插入类型的鸡在生长发育方面更加迅速，而呈插入/插入基因型的个体在各生长性状上将表现出最高数值[24]。

KLF家族的特征性结构是三个Krüppel样锌指结构，其与DNA的CACCC元件和富含GC区连接，可以参与转录的激活或抑制。而Krüppel-like factor15(KLF15)是KLF家族中的一员，参与着细胞的增殖分化过程[25]。鸡的KLF中含有一个2 bp的InDel突变位点，该位点的多态性显著影响着鸡的生长及胴体性状，呈插入/插入基因型的鸡在体重等生长指标方面显著优于其他基因型的鸡[26]。

作为肉鸡最重要的生长性状，鸡的产肉量直接影响着肉鸡养殖业创造的经济效益。Qiu等[27]对鸡PIT1基因做出研究，它是重要的阻止特异性转录因子，参与生长激素、促甲状腺素β亚单位、催乳素等基因表达量的调控。此基因中的一个57 bp InDel位点与鸡的生长和屠体性状呈极显著相关，显著影响着鸡的体重、胸角宽、全净膛等指标。

中国地方鸡种经过长期的进化与选择，具有资源丰富、风味较优等优点，但仍需要改良地方鸡种生长较慢、饲料转化率低的缺点。经研究，SH3RF2基因中的InDel位点密切影响肉鸡的生长性状，但赵妤娟等[28]在对15个中国地方鸡种的研究中尚未见到缺失位点，检测结果全为非缺失纯合子。这说明若要利用SH3RF2基因来改良中国地方鸡品种，我们还需将缺失基因型引入中国地方鸡以进行杂交，才能获得一定的育种改良进展。

1.3.2 InDel标记在鸡抗病性状选育中的应用 鸡的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因是位于16号微小染色体上一组紧密连锁的基因簇，其表达产物与细胞的自我识别密切相关；而B-G基因位于MHC基因上的B基因座，是家禽特有的基因。它表达于红细胞、血小板表面，积极参与着家禽的免疫反应。吴允等[29]在鸡的MHC基因中的B-G基因中发现了327个InDel位点。2017年，吴允等[30]再次对MHC基因中的Brd2基因做出研究，发现参与研究的25个鸡种全部具有插入/缺失现象，这些InDel位于第一或第九内含子区，据此推测该InDel位点的多态性与Brd2基因的表达存在一定关联。

1.4 InDel标记在猪育种工作中的应用

1.4.1 InDel标记在猪生长性状选育中的应用 猪的生长速度与抗逆性都是重要的经济性状，与养猪业的经济效益密切相关。中国地方猪品种抗逆性好，但生长速度不及西方猪品种。刘安[31]对中国猪与西方猪品种进行了全基因组水平的比较分析，在全基因组水平上发现了200万个InDel位点，其中包括与猪的生长免疫表型等重要性状相关的InDel位点。

最初发现于结肠腺瘤样息肉(Adenomatous Polyposis Coli，APC)中的APC基因可以调节细胞增殖、影响细胞迁移，1986年被首次在人类身上发现，它是FAP的致病基因。研究显示，APC基因控制着细胞数量，是一种抑癌基因，在许多组织中均有表达，但它是唯一一个在结肠上细胞增殖中起“看门”作用的基因，研究表明，APC基因的早期突变在结直肠肿瘤的早期发展中起着重要的作用[32]。因此，APC基因也是一类与肿瘤生长相关的基因。何文波[33]对中外猪群APC7的2个SNP位点和2个indel位点进行研究，发现这些位点在中外猪种身上表现出较大的基因频率差异。启动子区域的indel位点构成的不同基因型在仔猪的初生重存在着明显的差异，在断奶重存在着极显著差异。这些结论为提升仔猪体重提供了科学依据。

1.4.2 InDel标记在猪繁殖性状选育中的应用 八聚体结合转录因子-4(Octamer-binding Transcription Factor-4 ，Oct4)基因与哺乳动物生殖细胞的形成和维持密切相关，缺失Oct4基因会引起原始生殖细胞凋亡，影响哺乳动物的繁殖性能。任发[34]发现大白猪的Oct4基因上的12 bp InDel位点与大白猪公猪的睾丸重、睾丸长周长、睾丸短周长均具有显著相关，这证明Oct4基因上的12 bp indel位点对公猪的繁殖性状具有显著影响。这一研究成果为猪品种的选种选育、建立高繁殖力性状主群提供了科学依据。

2 总结与展望

InDel标记数量大、分型简单的优点，可以广泛应用于动物育种工作中，为改良动物经济性状提供原材料与科学依据。在传统的牛、羊、猪、鸡养殖业中均已发挥重要作用。将InDel位点带来的基因型频率差异与家畜家禽的体尺等重要性状数据资料相互关联分析，可以寻找出不同基因型在性状上造成的表型差异以提高分子标记育种的效率。但迄今为止，InDel位点多处于内含子区域，其对表型性状的影响机制研究还不是十分透彻，这降低了利用InDel进行动物育种的可信度，在实际生产中常常不被采用。在后续的研究中，探究InDel位点是如何影响动物性状将成为研究的重点。