外泌体在抗结核感染疫苗开发中的作用研究进展

高佳慧，耿 建

（蚌埠医学院检验医学院，安徽 蚌埠 233030）

结核病（TB）是威胁人类健康的全球卫生问题。随着抗结核药物的相继问世，特别是儿童接种卡介苗后，结核病的发病率大幅度降低。但结核分枝杆菌耐药菌株的出现以及艾滋病发病率的增加使得结核病有“死灰复燃”之势。据世界卫生组织（WHO）统计，我国是全球22个结核病高负担国家之一，也是全球27个耐多药结核病（MDRTB）高负担国家之一[1]。耐药结核的防治是我国亟待解决的难题。外泌体（exosomes）是机体大多数细胞能够分泌的具有脂质双层膜的纳米级囊泡结构。外泌体可以激活多种细胞因子，并且作为巨噬细胞感染结核分枝杆菌后呈递特异性抗原的载体[2]。另外，外泌体可以作为生物标志物和药物载体在肿瘤的诊断与治疗方面发挥作用[3]。外泌体对结核分枝杆菌的作用是开发抗结核感染疫苗的一个方向，更多的研究者瞄准该方向以探求更好的诊断和治疗结核病的方法。本文就最新的相关成果进行总结并对外泌体对结核分枝杆菌的作用进行综述。

1 外泌体

1.1 生物学特性

细胞外囊泡（EVs）是经由旁分泌得到的纳米级颗粒，主要包括外泌体（exosome）、微囊泡（microvesicle）、膜囊泡-凋亡小体（appoticbody）[4-7]，参与细胞间的信息交流。Théry 等[8]在 2018 年对其进行了更为准确的划分，将细胞外囊泡直径小于200 nm的称为medium/large EVs，直径小于100 nm的称为small EVs。外泌体是一种直径约为30～150 nm的微小的盘型囊泡。1983年，外泌体第一次在绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为exosome[9]。但在之前外泌体并没有得到人们的重视，被看作是一种细胞废弃物。因此，外泌体的相关结构与功能并未被挖掘。几乎所有类型的细胞在正常和病理状态下包括肿瘤细胞均可以分泌外泌体，其可以携带多种蛋白质、DNA、RNAs（微小RNA、环状RNA、长链非编码RNA等）、脂质、转录因子等生物分子。外泌体作为这些物质的载体，是细胞与细胞之间传递生物信息的介质，在细胞间的通讯过程中起着重要的作用。作为一种天然载体，外泌体存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁，通过内体途径形成主要来源于与溶酶体相关的多囊泡体，然后通过膜融合释放到细胞外基质，见图1。外泌体表面含有丰富的鞘磷脂、胆固醇等脂质类物质。外泌体中含有多种功能蛋白质，例如RAB蛋白、膜联蛋白、热休克蛋白家族（HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2、HSP90）以及 A33、MHC-Ⅱ、CD86、CD63、CD9等。某些外泌体蛋白质可以作为一种生物标志物在机体的病理生理过程中发挥重要作用。外泌体的表面还含有与肺癌密切相关的隶属于非编码RNAs（ncRNAs）[10]的miRNA[11]。相关研究表明[12]，外泌体在低氧 TME（TME）内调解如癌细胞与基质细胞等各种细胞类型间的双向信号转导，在肿瘤侵入、血管生成、免疫逃避中起着重要作用。

1.2 外泌体的标记与分离

外泌体与肿瘤治疗的相关性已经成为当下的研究热点之一。对外泌体的标记与分离是研究外泌体结构与功能的关键步骤。外泌体可以通过化学修饰、适体亲和力、两亲性分子插入等方法进行标记。相关研究表明可以通过超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法等方法对外泌体进行分离[13]，也有研究提出利用微流控及外泌体膜的相关性质来实现对外泌体的分离[14]。近年来还出现了与外泌体相关的蛋白分析新方法，较为典型的有小颗粒流式细胞仪、微核磁共振等离子外泌体（nPLEX）传感器和高敏感ExoScreen技术。另外，有相关研究创造性地提出了利用ExoTIC（外异性全隔离芯片）从癌症患者临床样本中分离EVs，这种方法便捷易行具有广泛的使用性。更有研究者提出构造人工囊泡（MIMV）来实现对外泌体的相关性研究。

图1 外泌体参与细胞间信息交流的4种途径[13]

2 结核分枝杆菌的生物学特性与耐药机制

2.1 生物学特性

结核分枝杆菌（Mtb）是引起人类结核感染的最常见原因。可以侵犯各器官，其中呼吸道感染引起的肺结核最为常见。Mtb的致病物质与其菌体成分如荚膜、脂质和蛋白质有关，其中包括索状因子、磷脂、硫酸脑苷脂、蜡质D在内的糖脂尤为重要。Mtb是一种胞内感染菌，机体对Mtb的免疫主要是以T淋巴细胞为主的细胞免疫。目前，临床上通过结核菌素皮肤试验、抗原检测、分子生物学鉴定、抗结核抗体（lgG）检测等方法进行鉴定。在最近的研究中，Cancino-Muoz I[15]等利用高分辨率的实时PCR、Sanger测序等技术鉴定了人和牛宿主的491个样本，提出了SNP的方法来治疗基因型结核分枝杆菌复合菌株。Shin S等[16]对用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的GENEDIA MTB/NTM试剂盒的诊断性能进行了评估。

2.2 耐药机制

近年来，结核病“死灰复燃”并在全球大范围流行，还出现了耐药菌株。WHO统计指出中国每年结核新发病例在90万例左右，新发耐药结核患者约5.8万例[1]。结核病易感者及携带者是防治结核的重中之重。结核分枝杆菌的耐药机制尚未研究透彻，而耐多药结核病的出现无疑给Mtb研究者带来新的挑战。

合理的化学药物治疗是控制结核病发展、复发及抑制耐药性产生的关键。目前用于临床的一线抗结核药包括异烟肼、利福平、乙胺丁醇等。但随着药物的长期使用，新发耐多药结核病层出不穷。抗结核药的作用机理主要是通过阻碍结核分枝杆菌细胞壁、RNA以及蛋白质的合成，干扰结核分枝杆菌的生物代谢等来发挥作用。导致Mtb耐药的主要原因之一是基因突变。有研究表明[17]，结核分枝杆菌对异烟肼耐药的一个重要方面就是katG基因的突变。除此之外，inhA基因发生突变以及ndh等基因的突变也是引起异烟肼耐药的重要原因。另外，相关研究指出rpob基因突变可以导致大约95%利福平耐药菌株的出现，编码阿拉伯糖基转移酶的embABC操纵子基因突变可以导致Mtb对乙胺丁醇耐药，而细胞壁渗透性下降也是Mtb耐药的一个重要方面。另外研究[18]指出目前贝达喹啉、利奈唑胺、德拉马尼是耐多药结核的有效药物。耐药菌株的出现导致耐多药结核病的发展迅猛，使得打赢结核病的防治攻坚战更为艰难。

3 外泌体与结核分枝杆菌的相互作用

Mtb感染机体会激活机体相关的免疫应答。机体对Mtb的免疫主要是T淋巴细胞介导的细胞免疫。过往的研究指出在此细胞免疫中起到关键作用的是巨噬细胞。Smith等[19]研究发现被Mtb感染的小鼠巨噬细胞释放的外泌体可以显著影响T细胞应答。用BCG感染人单核细胞源性巨噬细胞（MDMs）可导致包括miR-155、miR-146a、miR-145 和 miR-21 在内的多种 miRNA的释放，这些miRNA被预测是与免疫相关的重要靶向基因。

3.1 抗原提呈作用

巨噬细胞具有识别结核分枝杆菌的能力，同时巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的场所。巨噬细胞识别结核分枝杆菌主要通过Toll样受体（TLR）进行，TLRs是跨膜蛋白受体，主要在单核巨噬细胞表面进行表达。另外，与巨噬细胞识别结核分枝杆菌相关的受体还包括NOD样受体、C型凝集素受体等。结核分枝杆菌与机体巨噬细胞接触被巨噬细胞吞噬后被细胞质膜包裹，与此同时巨噬细胞形成溶酶体，其内的溶菌酶、蛋白酶等物质可以将结核分枝杆菌的各种蛋白降解，得到易于转运的短肽片段。此时，主要组织相容性复合物（MHC）合成MHCs来发挥提呈活性成分和抗原的功能。MHC-Ⅰ类及MHC-Ⅱ类分子[20]将这些短肽片段呈递给巨噬细胞从而可以分别激活免疫系统的CD8+T、CD4+T淋巴细胞。其中CD4+T细胞所介导的免疫应答是主要的免疫应答。在进入内质网、高尔基体后，小分子被转运到巨噬细胞表面，被CD8+T细胞识别。同时CD8+T细胞可以释放穿孔素和颗粒酶，进行诱导靶细胞凋亡的机制Fas/FasL杀伤结核分枝杆菌。巨噬细胞在结核分枝杆菌的固有免疫系统中有重要的作用，例如TLR2[21]可以借助于其他的Toll样受体识别结核分枝杆菌细胞壁的糖脂类成分以此来在固有免疫中发挥作用。此外，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌利用胞内消化酶来杀伤结核杆菌，结核的感染可划分为3个阶段：无症状清除、潜伏感染、出现临床疾病。

3.2 细胞因子

细胞因子[22]在T淋巴细胞介导的细胞免疫中扮演着重要角色。巨噬细胞在结核分枝杆菌和其他生物因子的作用下可以分泌多种细胞因子来调节抗原提呈作用。如TNF-α、IL-1、IL-8、IL-12和IFN-γ等。TNF-α可以诱导巨噬细胞，通过抑制结核分枝杆菌的生长来介导抗结核免疫。IL-12在增强Th1型细胞免疫与特异性免疫关系中具有重要作用。IFN-γ、炎症细胞因子参与了肺结核的感染免疫[23]。巨噬细胞分泌的外泌体可以阻碍天然巨噬细胞的INF-γ途径的激活，抑制小鼠巨噬细胞表面MHCⅡ类和CD64分子的表达。另外，外泌体具有激活巨噬细胞、树突状细胞和初始CD4+T、CD8+T[24]细胞的能力。抗原刺激引起CD4+T细胞活化，活化后的CD4+T细胞可以释放细胞因子IFN-γ，它可以促进机体特异性地杀伤结核分枝杆菌，从而发挥保护性免疫来抗结核分枝杆菌的感染。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后，可以产生羟自由基、过氧化氢和超氧阴离子等自由基。这些自由基可以破坏Mtb的核酸多糖导致DNA突变，从而抑制结核分枝杆菌的杀伤作用。除此之外，宋群等[25]选取33例耐药肺结核、49例普通肺结核及51例健康志愿者展开对比，研究得出Th17/CD4+CD25+Foxp3+T平衡与结核病的发生与耐药结核病的产生密切相关。另外有研究者[26]在实验时将Mtb感染的Rab27a缺陷小鼠与野生型小鼠相比，发现其外泌体产量减少，抗原特异性T细胞激活就减少，控制Mtb感染的能力下降，从而可以看出外泌体对特异性T细胞免疫的影响。

4 外泌体疫苗的开发

如今广泛用于治疗结核病的疫苗的是卡介苗（BCGVaccine），是唯一获得许可使用的减毒活疫苗[27]。研究表明，BCG的亲本株为牛型分枝杆菌，失去了编码毒力因子的RD1区。新生儿接种卡介苗很大程度降低了结核病的发病率，可以预防儿童结核性脑膜炎和播散性结核病，但不能预防成年人感染MTB。所以，对于目前防治结核病的状况，需要进一步加强对抗结核感染药物研发。目前，市场和临床试验的抗结核疫苗大致分为三类[28]：基础性免疫疫苗、增强性免疫疫苗、TB治疗疫苗。其中VPM 1002是BCG的一个重组株，研究者利用48例新生儿进行临床试验证实VPM1002在安全性和耐受性上有很好的效果。MTBVAC也是一种直接用于减毒的疫苗。相关的疫苗还包括Ad35/Aeras40、Hybrid 1-IC31、Ruti疫苗、SRL-172 疫苗、DAR-901等。随着对外泌体研究的不断深入，外泌体作为生物标志物和天然载体的功能在肿瘤治疗、冠心病、感染性疾病的作用与日俱增。外泌体miR-21可以通过多种方式影响HCC细胞的生长，血浆miR-452[29]可以作为胃癌的生物标志物，外泌体miRNA可作为肺癌[11，30]诊断和预后判断的生物标志物。这些都为我们研究外泌体抗结核感染的疫苗提供了方向。

有研究指出纳米载体可向肿瘤细胞提供药物用于肿瘤的药物治疗且外泌体的miRNAs[31]有成为癌症诊断标志物的潜能。随着对结核发病机理的深入研究，阻碍结核病的发病过程可降低结核病的发病率。纳米载体无疑为治疗结核病提供了一个研究方向，那就是作为药物载体来输送靶向药物治疗结核病，甚至是用于输送核酸。Xu等[32]已成功开发出一种新的ROS响应性和肿瘤穿透性多前体药物纳米平台，用于靶向癌症治疗。

5 展望

对于目前TB感染和防控的现状，虽然存在抗结核的相关药物并且临床新药物的研究也有所进展，但耐多药结核菌株难保不会对这些药物再次产生耐药性。因此，需要进一步加强对MTB感染和抗MDR-TB的基础研究，积极研制新型治疗MDRTB患者的药物。另外，结核分枝杆菌感染是引起艾滋病（AIDS）患者最常见的机会性感染和病死的原因[31，33]。但外泌体的研究还处于初级阶段，并且Mtb逃避宿主细胞免疫监视和清除机制尚未明确。虽然外泌体对肿瘤治疗的作用研究有所进展，但外泌体抗结核感染疫苗的开发之路还很漫长。还有一点就是，相关的研究指出EV miRNA的分析还很欠缺[34]。