甘肃省道地药材黄芪、甘草、板蓝根中药饮片的微生物污染状况研究

孙 莺 ，王玉梅 ，何晓英 ，李 莉 ，牟建平 ，徐勤科 ，王亚丽 ，谢亲建 ，杨平荣

（1.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730000；2.国家药监局中药材及饮片质量控制研究重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.武警甘肃省总队医院，甘肃 兰州 730050）

中药饮片是指药材经过炮制后可直接用于中医临床或制剂生产使用的处方药品。中药饮片质量直接关系着临床用药的安全性、有效性[1]，微生物污染是饮片外源性污染的主要形式之一，也是影响人体健康的重要途径[2]。药品微生物控制是药品安全性保障的重要措施，因此，制定科学合理的中药饮片微生物限度标准是保证饮片微生物安全的关键，也是实现中药标准引领国际、中药产业健康发展的关键[3]。目前，国外药品标准如《欧洲药典》《美国药典》和《日本药典》均收载了天然药（生药）的微生物检查方法和限度标准，《中国药典》2015年版四部[4]通则“1107非无菌药品微生物限度标准”首次收载了中药饮片的微生物限度标准，但仅针对研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片规定了沙门菌和耐胆盐革兰阴性菌限度标准，暂未规定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数限度，更没有其他中药饮片的微生物限度标准，导致中药饮片的卫生质量缺乏全面的评价标准，使中药饮片在应用中存在潜在的安全风险。有研究表明，中药饮片微生物污染情况比较严重，卫生质量亟待提高，微生物限度标准亟待完善[5-9]。甘肃是全国中药材资源大省，素有“千年药乡”之称，特别是道地药材种植已形成一定规模，本研究以3种甘肃道地药材黄芪、甘草、板蓝根中药饮片为研究对象，每种饮片30批共计90批，考查微生物污染状况，初步掌握微生物污染负载水平，为中药饮片微生物污染风险评估和微生物标准的制定提供数据支持。

1 试验材料

1.1 仪器

超净工作台（上海苏净，SW-CJ-2D）；生物安全柜（ESCD，ClassⅡBSC）；生化培养箱 （上海一恒，BPMJ-250F）；PCR 仪（ABI，Veriti）。

1.2 试剂

pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（批号：20191102）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号：20190930）；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（批号：20191212）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号：20190912）；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基；肠道菌增菌液体培养基；RV沙门菌增菌液体培养基；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD）（批号：20181124）；三糖铁琼脂培养基（TSI）。均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.3 中药饮片

本研究选取我省3种道地药材品种黄芪、甘草、板蓝根的中药饮片，每个品种30个批次共计90批次。黄芪来源于甘肃、安徽、河北、陕西、四川的26个不同厂家；甘草来源于甘肃、安徽、北京23个不同厂家；板蓝根来源于甘肃、安徽、河北、陕西、四川的26个不同厂家。

2 试验方法

参照《中国药典》2015年版中“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则 1105）和“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（通则1106）进行检查[9]。

2.1 供试品溶液的制备

称取10 g样品，加入100 ml pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，振荡，制成1∶10供试品溶液。

2.2 需氧菌总数（TAMC）的测定

取“2.1”中1∶10供试液，用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍稀释至10-5，采用平皿法计数，1 mL/皿，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，33℃培养5 d。

2.3 霉菌和酵母菌总数（TYMC）的测定

取“2.1”中1∶10供试液，用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍梯度稀释至10-4，采用平皿法计数，1 ml/皿，平行制备2个平皿，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7 d。

2.4 控制菌的检查

2.4.1 耐胆盐革兰阴性菌（Bile-tolerant Gram-negitive Bacteria，BGB） 取“2.1”中 1∶10 供试液，按照 2015 年版《中国药典》四部通则“微生物计数法”[9]进行耐胆盐革兰阴性菌的定量检查和定性检查。取10-1、10-2和10-3供试品稀释液1 mL分别接种至10 mL肠道菌增菌液体培养基中，35℃下培养48 h。取相当于1 g样品的上述预培养物接种至100 mL肠道菌增菌液体培养基中，33℃培养24 h后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33℃培养24 h。

2.4.2 沙门菌 取饮片样品10 g，接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，33℃下培养48 h。取上述培养物0.1 mL接种至10 mL RV沙门菌增菌液体培养基中，33℃下培养48 h。取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33℃下培养48 h。

2.5 菌种鉴定

从“2.4.1”中的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板和“2.4.2”中的木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板选取不同典型形态的微生物，进行菌株的分离纯化，PCR扩增16s rRNA基因，以27F和1492R为引物，进行16s rRNA片段扩增，将扩增片段进行测序（通用生物测序），将所测得的16s rRNA基因序列用BLAST软件进行相关序列的对比，确定分离纯化所得到的细菌的种属。

3 结果

3.1 需氧菌总数检测结果

将需氧菌总数（TAMC）的结果取对数（以lgTAMC表示），分别以90批饮片样品的lgTAMC值为横坐标、lgTAMC频数为纵坐标做直方图和分布曲线，结果见图1。以黄芪、甘草、板蓝根各30批的饮片样品的lgTAMC值为横坐标、lgTAMC频数为纵坐标做直方图和分布曲线，结果见图2～4。本次试验所选取的90个批次中药饮片均检出需氧菌，lgTAMC的均值为3.573，最小值为2.021，最大值为5.989，见表1。由图1可知，90批饮片样品的lgTAMC值呈偏态分布。90批饮片样品的lgTAMC值均小于6.0，整体水平符合欧洲、日本、美国药典标准，各国药典与中药饮片相当的植物药或生药的微生物限度值见表2。

表1 饮片样品TAMC和TYMC测定结果

表2 各国药典与中药饮片相当的植物药或生药的微生物限度值

由图2～4可知，3种中药饮片中，黄芪的需氧菌污染程度最高，板蓝根需氧菌污染程度最低，其中黄芪中需氧菌总数最高值达106cfu/g。黄芪饮片样品的lgTAMC值为2.021～5.035，甘草饮片样品的 lgTAMC值为 2.114～5.106，板蓝根饮片样品的lgTAMC值为2.477～5.989，不同批次中药饮片微生物污染情况各不相同，其中板蓝根各批次间需氧菌总数差别尤为明显，这种差别最高达3.5个数量级。

图1 所有饮片样品lgTAMC直方图和分布曲线

图2 黄芪饮片样品lgTAMC直方图和分布曲线

图3 甘草饮片样品lgTAMC直方图和分布曲线

图4 板蓝根饮片样品lgTAMC直方图和分布曲线

3.2 霉菌和酵母菌总数检测结果

将霉菌和酵母菌总数（TYMC）的结果取对数（以lgTYMC表示），以90批饮片样品的lgTYMC值为横坐标、lgTYMC频数为纵坐标做直方图和分布曲线，结果见图5。以黄芪、甘草、板蓝根各30批的饮片样品的lgTYMC值为横坐标、lgTYMC频数为纵坐标做直方图和分布曲线，结果见图6～8。

90批饮片样品均检出霉菌和酵母菌，lgTYMC的均值为1.963，最小值为0.699，最大值为4.161，见表1。由图5可知，lgTYMC值呈偏态分布，其中超过70%的lgTYMC值为0.5～1.5，超过99%的lgTYMC值小于4.0，符合美国、欧洲、日本药典标准。全部饮片lgTYMC值小于5.0，整体水平符合欧洲、美国药典标准。只有1批板蓝根lgTYMC值大于4.0，小于5.0，不符合《美国药典》要求。由图6～8可知，3种中药饮片中，霉菌和酵母菌污染程度黄芪最高，板蓝根最低，其中黄芪中霉菌和酵母菌最高值达104cfu/g。黄芪饮片样品的lgTYMC值为1.000～3.161，甘草饮片样品的 lgTYMC值为0.699～3.114，板蓝根饮片样品的lgTYMC值为0.699～4.161，不同批次中药饮片微生物污染情况各不相同，其中板蓝根各批次间霉菌和酵母菌数差异最大，质量最不稳定，这种差别最高达3.5个数量级。

图5 所有饮片样品lgTYMC直方图和分布曲线

图6 黄芪饮片样品lgTYMC直方图和分布曲线

图7 甘草饮片样品lgTYMC直方图和分布曲线

图8 板蓝根饮片样品lgTYMC直方图和分布曲线

3.3 控制菌测定结果

3.3.1 耐胆盐革兰阴性菌 耐胆盐革兰阴性菌将N值进行转化，N＜10 转化为 0.5，10＜N＜1×100 转化为 1.5，1×100＜N＜1×1 000转化为2.5，N＞1×1 000转化为3.5，转化数值做的直方图和分布曲线见图9。90批中药饮片中，44批检出耐胆盐革兰阴性菌，占48.9%，其中黄芪17批，甘草20批，板蓝根7批，分别占各自批数的56.7%、66.7%、23.3%。不同批次和来源的同种饮片耐胆盐革兰阴性菌差别很大。

图9 所有饮片样品耐胆盐革兰阴性菌直方图和分布曲线

3.3.2 沙门菌检测 经检验，90批饮片中检出沙门菌2批，都是甘草饮片，不符合各国药典标准。沙门菌被认为是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一，需要引起关注。

3.4 菌种鉴定结果

挑取平板上的典型菌落，16s rRNA鉴定结果见表3。不同饮片品种中污染的微生物分布于4个科，8个属。其中检出比例最高的为肠杆菌科和芽孢杆菌科，其次为纤维杆菌科和乳杆菌科。不同饮片样品中检出的污染微生物种类具有明显的差异，板蓝根中检出4种典型污染菌，黄芪和甘草中各检出3种典型污染菌。值得注意的是，从中药饮片中检出了阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌这些重要的条件致病菌，检出芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等耐热微生物，这些细菌为环境中常见细菌，可能在种植和生产加工环节引入，而芽孢杆菌属细菌较难杀灭。因此，对于一些冲泡或直接服用的饮片，存在一定的用药风险。

4 讨论

4.1 中药饮片微生物污染情况

甘肃省是中药材资源大省，黄芪、甘草、板蓝根为甘肃道地大宗中药材，均属于未经炮制处理的药材，需要煎煮服用。90批饮片需氧菌总数平均值高于103cfu/g，最大值达106cfu/g；霉菌及酵母菌总数平均值达到102cfu/g，最大值超过104cfu/g。耐胆盐革兰阴性菌检出率48.9%，检出沙门菌2批，都是甘草饮片。黄芪的微生物污染程度最高，板蓝根污染程度最低。按照《中国药典》2015年版要求，不合格率为2.2%

4.2 基于微生物污染情况的建议

本研究发现饮片微生物负载水平较高，卫生状况欠佳，中药饮片中污染的需氧菌和耐胆盐革兰阴性菌数量较大，虽然通过传统的加工炮制方法如煎煮、熬制等能消除饮片中部分微生物对人体健康的直接威胁，但微生物的生长代谢对中药饮片的有效成分、药效会带来不可逆的转变。因此，全面加强中药饮片微生物污染的控制，是加强外源性污染物控制、提高中药饮片临床使用安全的重要工作之一。我国中药饮片微生物标准与发达国家存在一定差距，严重制约中药产业走向世界。基于本研究结果，建议进一步开展中药饮片微生物危害的风险评估工作，建议根据中药饮片的入药部位、药性、炮制工艺等建立合理的微生物限度标准，引导生产企业加强过程控制，逐步规范中药饮片生产、储运的各环节，降低微生物负荷和中药饮片的安全风险，既可以加强药品质量安全，又能为促进中药饮片产业的健康发展起到积极作用。

表3 菌种鉴定结果