夏枯草精准煮散饮片与普通饮片煎煮质量评价

曹丽萍，林晓燕，李曙光，梁 奇*

［1.深圳市宝安中医院（集团），广东 518000；2.深圳市中医院，深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东 518033］

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗。性味辛、苦，寒，具有清肝泻火，明目，散结消肿的作用［1］。夏枯草的有效成分为三萜类及其皂苷类成分，药理研究显示其有抗肿瘤、降血脂、抗氧化等作用［2-3］。中药煮散是传统用药形式，唐宋时期盛行“药力尽出”的煮散，明清时代煮散因为破坏了药材形态引起辨药之难，逐渐被保全药材鉴别特征的中药饮片所取代。精准煮散饮片［4-6］是基于传统中药煮散用药方式，经标准化生产、批内质量均一的中药粗颗粒或粗末饮片。本文通过考查干膏收率、含量均一性、指纹图谱相似度等指标为研究对象，对比夏枯草精准煮散饮片与普通饮片质量差异，进行质量综合评价，揭示精准煮散饮片的优势，为提高中医临床疗效的有效稳定提供数据支撑。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪Shimadzu LC-20AT，SIL-20A自动进样器，CTI-20AC柱温箱，SPD-M20A检测器，LC solution数据处理工作站（日本岛津公司）；Diamonsil（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；电子天平（准确至万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；溶剂过滤器（天津津腾公司）。迷迭香酸对照品（HPLC纯度大于98%，批号20283-92-5，购于南京春秋生物公司）。3批次的夏枯草饮片（S1：批号1810001、S2：批号1810002、S3：批号1810003）各500 g，由市场购买，经深州市中医医院药检室简晓莉副主任中药师鉴定为2020版《中国药典》（一部）夏枯草品种。甲醇、乙腈、冰醋酸为色谱纯（Fisher），其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同粒度夏枯草精准煮散的制备 《本草纲目》中记载夏枯草，治疗赤白带下、血崩，研末服用。《张氏医通》收载夏枯草散，其中夏枯草为末，茶水调下。查阅文献得知，“末”约粒度介于二号筛（24目）与四号筛（65目）之间。参考古代典籍记载和现代应用研究，以S1夏枯草原饮片作为T1样品，同时取S1夏枯草原饮片粉碎，过筛，得到5～10目（T2样品，95%的粉末粒度为2~4 mm）、10～24目（T3样品，95%的粉末粒度为0.85~2 mm）、24～65目（T4样品，95%的粉末粒度为0.25~0.85 mm）和65～80目（T5样品，95%的粉末粒度为0.18~0.25 mm）等不同粒度的煮散饮片［7-8］。

2.2 迷迭香酸含量测定方法研究

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定适量的迷迭香酸对照品，加甲醇制成每1 ml含迷迭香酸分别为8.868 2、17.736 5、44.341 2、88.682 4、133.023 6和177.364 8 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取已制备的精准煮散样品100 g，称定，加12倍量水浸泡10 min，煮沸20 min，滤得煎煮液，剩下的残渣加10倍量水煎煮20 min。合并两次煎煮液，浓缩成100 ml溶液，得到相当于含饮片1.0 g/ml药液，为夏枯草精准煮散储备液。精密量取上述储备液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取适量试液离心，取上清液，即得供试液。

2.2.3 色谱条件Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱，以0.1%冰醋酸水（A）-乙腈（B）为流动相，按表1中进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；进样量10 μl，检测波长为330 nm，按迷迭香酸峰计算理论板数应不低于6 000，色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 对照品（A）供试品（B）空白溶剂（C）HPLC色谱图

2.2.4 线性范围考查 取迷迭香酸系列对照品溶液，按以上色谱条件进样，以浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得迷迭香酸回归方程：Y=26 705.7X+1 924.6（r=0.999 8）。结果表明，迷迭香酸在8.868 2～177.364 8 μg/ml之间，与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5精密度试验 取17.736 5 μg/ml的迷迭香酸对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.53%，说明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取T4供试液，分别在第0、2、4、8和12 h进样，测定迷迭香酸峰面积，RSD为0.77%，说明溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一T4供试液6份，按上述色谱条件，测定迷迭香酸含量。结果迷迭香酸含量为45.35 μg/ml，RSD为0.64%，说明重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的供试液（迷迭香酸含量为45.35 μg/ml）9份，每份0.5 ml，分别加13.302 4 μg/ml的迷迭香酸1、2和3 ml各3份，按上述色谱条件测定峰面积，计算加样回收率。结果迷迭香酸平均回收率为99.70%，RSD为1.01%，见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

2.3 粒度评价S1按“2.1”项下方法制备不同粒度煮散饮片，取S1及不同粒度煮散饮片各100 g，加12倍量水浸泡10 min，煮沸20 min，滤得煎煮液，剩下的残渣加10倍量水煎煮20 min。合并两次煎煮液，浓缩成100 ml溶液，得到相当于含饮片1.0 g/ml药液。精密吸取各供试液2 ml于蒸发皿中，干燥至恒重，称重，计算出膏率，结果分别为0.65%±0.04%、0.69%±0.05%、0.90%±0.03%、1.11%±0.10%和1.16%±0.09%。与原饮片相比，煮散饮片的出膏率增加，粒径不同出膏率不同，其中T1、T2样品出膏率较低，T3、T4样品出膏率相对较高，T5样品出现糊化。出膏率及澄清度结果见表3。故确定夏枯草精准煮散的粒度10～65目为宜，在后续试验中采用10～65目样品。

表3 夏枯草原饮片与精准煮散饮片粒度考查

2.4 迷迭香酸含量的均一性评价 分别称取3批不同批次的夏枯草原饮片，各称100 g，分别标记为（S1～S3），另取与S1～S3相同批次的夏枯草饮片各适量等比例混合，粉碎过筛，取10～65目粉碎物，充分混匀，制成夏枯草煮散饮片，称取3份夏枯草煮散饮片，每份100 g，标记为（S4～S6）。S1~S6共6份样品，每份各100 g，按“2.2.2”项下方法分别煎煮浓缩为1.0 g/ml药液。精密量取浓缩液1 ml置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，取适量试液离心，取上清液，即得待测试溶液，按“2.2.3”项下色谱条件分别测定S1~S6中迷迭香含量。结果夏枯草原饮片提取液中迷迭香酸含量为（0.312±0.09）mg/g，RSD为28.17%；夏枯草精准煮散饮片提取液中迷迭香酸含量为（0.298±0.01）mg/g，RSD为3.88%。见表4和表5。结果表明，混合煮散前，各批次夏枯草饮片药材中指标成分含量差异较大，将其混合制成煮散饮片后，迷迭香酸成分的含量RSD显著下降，说明质量均一性更好。

表4 夏枯草原饮片提取液中迷迭香酸含量测定结果

表5 夏枯草精准煮散饮片提取液中迷迭香酸含量测定结果

2.5 指纹图谱分析

2.5.1 色谱条件 与“2.2.3”项下色谱条件相同，按迷迭香酸峰计算理论板数应不低于6 000，色谱图见图2。

2.5.2 样品测定 按“2.4”项下方法制备供试液，精密吸取，供试品溶液注入HPLC记录色谱峰信息。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2004A版）对夏枯草原饮片和煮散饮片样品指纹图谱相似度进行比较，见图2和表6。结果显示：应用现有的检测方法，夏枯草原饮片和煮散饮片样品的色谱峰可以很好地匹配，相似度结果显示：煮散饮片（S4～S6）的相似度均1，指纹图谱匹配更好。说明了精准煮散饮片与原饮片在提出成分的属性上没有显著差异，采用指纹图谱相似度分析法可用来鉴别夏枯草煮散饮片的真伪情况。以精准煮散饮片水煎液中迷迭香酸的平均峰面积为基准，计算饮片和精准煮散饮片水煎液各共有峰的相对峰面积，见表7。

图2 夏枯草原饮片（S1~S3）及精准煮散饮片（S4~S6）指纹图谱

表6 夏枯草原饮片及精准煮散饮片水煎液指纹图谱的相似度

表7 夏枯草原饮片及精准煮散饮片水煎液中共有峰的相对峰面积（±s）

表7 夏枯草原饮片及精准煮散饮片水煎液中共有峰的相对峰面积（±s）

峰号 tR（min） 市售饮片 精准煮散饮片15.64 0.476±0.07 0.528±0.05 2 18.51 0.025±0.004 0.046±0.01 3 19.27 0.049±0.01 0.065±0.01 4 23.99 1 1 1

3 讨论

煮散最早记载于秦，汉唐开始较大规模应用，宋代发展到巅峰，明清时因较饮片难以鉴别真伪等原因而逐渐衰落［9］，随着现代仪器设备和鉴别手段的发展，难以鉴别真伪的缺点被克服，煮散具有的节省药材、降低成本、提高药物有效成分煎出率等方面的优势得到凸显，煮散又逐步开始受到青睐，应用规模逐渐扩大。

本试验选取中药处方中常见的夏枯草为研究对象，对比夏枯草精准煮散饮片与普通饮片质量差异，选取夏枯草3个批次，每批次3个规格制成精准煮散，分别测定了出膏率和迷迭香酸含量。与原饮片比较，夏枯草精准煮散出膏率和含量均比原饮片有一定程度增加；且粒径越小，出膏率越高。其中10~24目、24~65目和65～80出膏率相对较高，但在65~80目时，出现轻微糊化现象，大批量的煮散10~65目较为合适。

2020 版《中国药典》中把迷迭香酸作为夏枯草含量测定的成分，规定夏枯草饮片中含迷迭香酸（C18H16O8）不得少于0.20%。本文以迷迭香酸为指标成分，通过HPLC含量测定与指纹图谱分析法研究对了夏枯草煮散饮片与市售饮片的质量差异。结果表明，夏枯草精准煮散饮片与市售饮片在成分上没有差异，但制成煮散饮片后，迷迭香酸成分的煎出量明显增加，质量均一性更好。