功能基因组注释探讨解淀粉芽孢杆菌的益生机制

张红娜，周玉法，庞全海

(1 .河北经贸大学 生物科学与工程学院，石家庄 050061；2.山西农业大学 动物科学学院，山西太谷 030801；3.泰安市岱岳区畜牧局，山东泰安 271000)

为了降低畜产品中的药物残留以及控制养殖业中耐药菌的散播，目前益生菌在畜牧业中得到广泛应用，不仅因为日粮中添加益生菌可以作为抗生素的替代品促进动物的生长，提高免疫力和维持肠道健康，而且益生菌的添加还可改善养殖环境，提高畜产品的存储质量[1-2]。

芽孢杆菌属中已经有许多菌株被用作益生菌，如枯草芽孢杆菌、克劳斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等，其孢子处于休眠状态具有耐高温、耐干燥等特性，在肠道内萌发为营养细胞对动物的肠道健康起着至关重要的作用[3-4]。这些益生菌之所以具有益生功效与其能产生大量的次级代谢产物密不可分，比如生物活性肽、聚酮类化合物、脂肪酸、硫辛酰胺等[5-7]。笔者前期研究中发现，日粮中添加解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238可改善蛋鸡盲肠菌群多样性，调控肠道粘膜中碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂类消化和肠道吸收等生物学过程相关基因的表达，增强肠道营养吸收能力和饲料利用率，从而提高蛋鸡生产性能[8-9]。

目前，关于动物益生菌的研究主要侧重于从动物的角度探讨其发挥益生功效的机理，但很少有研究从益生菌的功能基因组学角度去阐述其益生机制[10-11]。功能基因组学又被称为后基因组学，可以从基因组整体水平上对基因功能进行比较和分析，是挖掘基因功能的有效手段[10]。因此，本研究利用功能基因组学的方法，通过分析解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238的基因组特点，明确其在动物机体内发挥益生功效的相关机制，为后续开发和利用提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

DNA提取试剂盒由QIAGEN公司提供；Tiangen凝胶回收试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；Nextera XT DNA sample preparation kit由Illumina公司；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies公司)；Illumina MiSeq测序平台(Illumina公司)。

1.2 基因组测序和注释

解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株由山东宝来利来生物工程有限公司提供，经鉴定为纯菌种。首先，将解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株在TSB琼脂板中37 ℃培养24 h，再在TSB液体培养基中37 ℃培养24 h，绘制生长曲线，选择OD600=1.2，浓度为108cfu/mL的菌液进行后续检测。参照试剂盒说明提取和纯化菌株DNA，根据Nextera XT DNA sample preparation kit构建DNA片段文库，随后在Illumina MiSeq平台进行测序。

测序结果使用Trimmomatic软件[12]进行修剪处理，用FastQC软件[13]进行质量评价，合格后用CLC Genomics Workbench、A5-miseq[14]和SPAdes[15]软件对序列片段进行组装，在组装的过程中考虑contigs的数量、平均长度、N50和最大长度。应用Mauve软件[16]对contigs进行排序后提交至RAST server[17]中进行自动基因 注释。

1.3 基因组比较

利用R2Cat、BRIG和NCBI中BLAST做基因组比较[18]。选取已提交的全基因组序列且与解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238具有高同源性的7个芽孢菌属的菌株作为比较对象。利用Genome-Genome Distance Calculator (GGDC) 2.0 BLAST+计算体外DNA-DNA杂交值(DNA-DNA hybridization，DDH)，70%DDH被看做是不同种的临界值[19]。采用JSpecies软件[20]计算不同菌株序列间的平均核酸同源性(Average Nucleotide Identity，ANI)，当ANI>95%且与70% DDH的分析结果一致则认为是同一个 菌种。

1.4 基因组数据挖掘次级代谢产物和水解酶

采用RAST server对推测的蛋白序列进行注释。借助于CAZymes Analysis Toolkit[21]和MEROPS[22]数据库对水解酶和肽酶进行分析，利用在线工具NP.searcher和antiSMASH[23]鉴定次级代谢产物的基因簇，用NRPSpredictor2分析能合成次级代谢产物的非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPS)[24]。与参照基因相比，当解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238拥有>65%的同源性且覆盖率>85%，则认为是相同的基因或基因簇。对于假定的蛋白序列参照NCBI的非重复数据库用BLASTP算法进行预测，设置E-value<1×10-5。

2 结果与分析

2.1 基因组比较和注释

经基因组测序发现，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组大小约为3.88 Mb，G+C含量为46.6%，RAST自动注释了3 941编码序列，其中89个对应rRNA基因。利用NCBI数据库进行全基因组比对发现，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与其他解淀粉芽孢杆菌具有最高的同源性为99%，序列覆盖范围为95%～96%(图1)。解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与NCBI数据库中其他解淀粉芽孢杆菌的平均核苷酸同源性>95%，具有高一致性(表1)。从推测DDH可知，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与解淀粉芽孢杆菌CAU B946的预测值为98.89%(表2)。总之，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238在分类上属于解淀粉芽孢杆菌。

2.2 抗菌代谢产物

在解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株基因组中，共有8个基因簇编码抗菌次级代谢产物，且与其他芽孢杆菌具有高的一致性，主要包括聚酮类化合物、环二肽、非核糖体合成的脂肽、细菌粘附和聚集基因(图2)。

2.2.1 聚酮类化合物 经AntiSMASH和NP.searcher servers分析(图2)，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中bae基因簇(72.5 kb)负责聚酮类化合物bacillaene的生物合成，与CAU B946、FZB42(B.amyloliquefaciensFZB42)分别具有100%、97%的同源性，并且解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与CAU B946基因组中bae基因簇的构成分布相同。解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238的基因组中dfn基因簇(70 kb)参与聚酮类化合物difficidin的生物合成，与CAU B946具有88%的同源性，其差异主要集中在dfnI和dfnD基因开放阅读框。此外，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中mln基因簇(54.8 kb)负责大环内酯类抗生素(macrolactin)的生物合成，与CAU B946的同源性达到98%。

2.2.2 环二肽 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中编码环二肽bacillibactin基因簇为11 kb，与CAU B946的同源性为96%；编码环二肽bacilysin的基因簇与M27(B.amyloliquefacienssbusp. plantarum M27)具有100%的同源性 (图2)。

2.2.3 非核糖体合成的脂肽 在解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238的基因组中含有表面活性素(surfactin)、依枯草菌素(iturin)、泛革素(fengycin)的编码基因簇(图2)。表面活性素基因簇与CAUB 946有95%的同源性，由4个开放阅读框组成，分别是srfAA、srfAB、srfAC和srfAD。依枯草菌素基因簇与FZB42有98%的同源性，也包含4个开放阅读框，分别是ituAA、ituAB、ituAC和ituAD。泛革素基因簇与FZB42有98%的同源性，含有5个开放阅读框，分别是fenA、fenB、fenC、fenD和fenE。同时，AntiSMASH工具还预测到了罗克霉素(locillomycin)的编码基因簇，且与LFB112(B.amyloliquefaciensLFB112)有99%的同源性。

图1 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与7株近缘的芽孢杆菌基因组比较分析Fig.1 Genome comparison between genome of BLCC1-0238 and seven closest Bacillus species

表1 8个芽孢杆菌基因组平均核苷酸同源性分析Table 1 Average nucleotide identity analyses among 8 genomes of Bacillus species

表2 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238与7个近缘芽孢杆菌基因组的DDH预测结果Table 2 DDH prediction of genomes from BLCC1-0238 and 7 closest Bacillus species

2.2.4 细菌黏附素和聚集素 通过对生物表面活性素的基因簇进行RAST自动注释分析，发现一个细菌素编码基因。经tBlastN进一步分析，发现一个编码肽基脯氨酰异构酶的基因序列(PrsA)，该基因编码的蛋白含有296个氨基酸，能协助细菌粘附在肠道细胞表面。

2.3 耐酸基因和水解酶

经分析，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株中含有12个与抗酸胁迫相关的基因(表3)，含有7种酶参与蛋白降解(表4)。

3 讨论与结论

本研究从益生菌自身角度分析全基因组功能，发现解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中含有与抗菌物质合成相关的基因簇。研究表明，芽孢杆菌通常可以产生化学结构各异的多种抗菌物质，参与抗菌物质合成的基因碱基数可达350 kb，但目前还没有发现一种芽孢杆菌可同时拥有这些编码基因[25]。合成表面活性素的基因簇通常超过25 kb，包含4个开放阅读框[26]；合成依枯草菌素的基因簇也包括4个大的开放阅读框，2个基因簇在枯草芽孢杆菌中广泛存在[27]，这与本研究结果一致。

本研究发现在解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中合成表面活性素和依枯草菌素的基因簇比较保守，且分别与已经报道的解淀粉芽孢杆菌CAUB 946 和FZB42具有高的同源性。表面活性素是一种环状的七肽结构，含有链接在β-羟基脂肪酸链上的D-氨基酸残基，能够通过改变细胞膜的结构发挥溶血，抗菌和抗病毒的作用[28]。肠道中表面活性素的存在会增加芽孢杆菌和肠道黏膜的相互粘附作用，可有效的阻断致病菌的入侵，与肠道黏膜的黏附能力也是考量益生菌的重要指标[26]。依枯草菌素的结构与表面活性素相似，含有半个环状的七肽结构和一个β-羟基脂肪酸链。由于多肽链上氨基酸残基的易变性，依枯草菌素在形态上具有多样性，可分为依枯草菌素A、B、C、D和芽孢菌霉素D、F、L、Lc和枯草菌抗霉素[27]。研究表明，依枯草菌素对植物真菌病原具有良好的拮抗作用[29]。笔者前期研究表明，在蛋鸡日粮添加解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238后，盲肠中乳酸杆菌属等有益菌的相对丰度增加，而很多条件性致病菌的相对丰度降低，说明解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238能够在一定程度上抑制病原微生物的繁殖，参与调节肠道微生物之间平衡，这与该益生菌的抗菌代谢产物密切相关[9]。

BLCC1-0238 (上方)，CAU B946 (绿色箭头，下方)，FZB42 (蓝灰色箭头，下方)

表3 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238中耐酸性相关基因Table 3 Genes related to acid tolerance in BLCC1-0238

表4 解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株中水解酶相关基因Table 4 Genes related to hydrolytic enzymes in BLCC1-0238

本研究解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中还包括合成脂肽类抗生素物质泛革素和罗克霉素的基因簇。泛革素类似于制磷脂菌素是环状的十肽结构，含有4个D-氨基酸残基，这些氨基酸残基连接在含有16-19个碳原子的β-羟基脂肪酸链上。研究表明，泛革素抗菌物质能有效地对抗丝状真菌，抑制磷酸酶A2的活性[30]。罗克霉素是环状脂肽的新家族，试验表明它能有效的对抗细菌、真菌和病毒，由于其具有较低的溶血活性，因此具有较好的实践应用前景[31]。与bacillaene和difficidin生物合成相关的聚酮类化合物合成酶I 型bae和dif基因簇也在本研究解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238中找到。研究表明，这些聚酮类化合物能有效地抑制细菌蛋白的合成[32]。另外，具有抗菌作用的聚酮类化合物大环内酯抗生素的生物合成基因簇也在解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238中存在。前期研究中日粮添加解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238后，蛋鸡血清中IL-1和IL-6炎症因子下降[8]，而且肠道粘膜中编码组氨酸脱羧酶的基因显著下调，组胺生成下降，从而减少机体发生过敏性炎症。这与该益生菌能够编码聚酮类代谢产物相关[9]。

益生菌需要在肠道中存活才能发挥益生功效，这就需要益生菌有能力对抗肠道的pH和胆汁盐等恶劣环境。本研究中解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238菌株含有抗酸胁迫相关的基因，σB因子和σB调控蛋白。研究表示，σB因子包括150多个调节子成员，当芽孢杆菌遇到酸、盐、乙醇、NO、高温或低温等多种刺激的时候，会表达多种调节因子进行抵抗，赋予细胞对抗恶劣环境的能力[33]。σB因子的活化受到rsbV/rsbW保守基因和RsbS基因的调控，这些基因也都在解淀粉芽孢杆菌解BLCC1-0238菌株的基因组中找到，可使细胞应对遇到的胁迫环境[34]。

本研究解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238基因组中还有大量编码水解酶的基因，其中就有胆汁盐水解酶，它能使细菌对抗胆汁盐的胁迫[35-36]。此外，植酸酶和糖苷水解酶在动物的消化吸收中起重要作用，尤其是单胃动物，比如：猪、家禽和鱼等[35]。前期结果证实解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238不仅能够降低料蛋比，增加蛋壳厚度和强度，而且在能够上调肠道粘膜上与碳水化合物代谢、脂类消化和肠道吸收等生物过程相关基因的表达，与本次结果相一致。因此，解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238通过自身表达水解酶和增强肠道物质代谢与营养吸收能力等多个角度来提高蛋鸡生产性能[9]。

本研究通过全基因组分析在解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238发现多个参与抗菌肽合成的基因簇、耐酸相关基因和编码水解酶的基因。这些基因的存在有助于动物机体对抗病原菌和各种胁迫因素，还有利于机体对饲料营养的消化和吸收。综上所述，本研究从益生菌基因组的角度阐述解淀粉芽孢杆菌的益生机制，为进一步开发利用解淀粉芽孢杆菌提供科学数据。