rpoB、gyrA、cheA基因在芽孢杆菌鉴定上的应用

颜静婷，乔 凯，蔡燕飞

(华南农业大学 资源环境学院，广东 广州 510642)

微生物肥料被视为化学肥料强有力的替代品，其中，芽孢杆菌是微生物肥料中最常添加的菌属。在自然界，芽孢杆菌属()是一类需氧或兼性厌氧，可产生内生孢子的革兰氏阳性细菌。当接种到植物根际时，芽孢杆菌可通过增溶磷钾、固氮、产生拮抗物质和分泌植物激素等作用促进植物生长。同时，芽孢杆菌的内生孢子具有较强的抗逆性，因此用芽孢杆菌制作的微生物肥料拥有更长的货架期和巨大的生产优势。

目前，已投入使用的芽孢杆菌属菌种包括巨大芽孢杆菌()、枯草芽孢杆菌()、解淀粉芽孢杆菌()、地衣芽孢杆菌()、多黏类芽孢杆菌()和胶质芽孢杆菌()等。不同芽孢杆菌具有不同的促生性能和遗传特性，这种特性甚至表现出菌种水平上的一致性，例如枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌通常能够更好地定殖在植物根际，而蜡样芽孢杆菌()和苏云金芽孢杆菌()则会产生特定的毒性。出于生物安全性考虑，现行的微生物肥料行业标准(NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技术准则》)对生产菌种的安全性做了分级：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌()、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌属于一级安全水平，在应用前可免做毒理学测试；蜡样芽孢杆菌在应用前需验证其是否具有致病性；而炭疽芽孢杆菌()则被禁止在微生物肥料中使用。从生产的角度来说，菌种的准确鉴定不仅有助于避免微生物肥料行业以次充好，也是保证产品安全性的必要措施。

长期以来，生产上普遍使用生理生化鉴定和16S rRNA基因分型来鉴定芽孢杆菌，但一些近缘种，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，具有相似的表型特性和极高的16S rRNA基因序列同源性，16S rRNA基因分型和表型分类方法无法将其区分；因此，需要建立一种可以准确鉴定芽孢杆菌微生物肥料菌种的方法。、和基因作为看家基因，具有高度保守性，而且在所有的细菌中都只有单一拷贝，可避免16S rRNA基因因多拷贝而表现出的异质性，且其核苷酸序列长度和进化速度都远高于16S rRNA，显示出更高的遗传差异。也就是说，、和基因在芽孢杆菌的鉴定上具有更强的分辨力。随着芽孢杆菌属全基因组测序工作的推进，许多菌种的、和序列均可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中获得，这也为菌种的鉴定工作提供了便利。

本研究首先针对芽孢杆菌微生物肥料的常用菌种——巨大芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌()、地衣芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌组、枯草芽孢杆菌组和蜡样芽孢杆菌组，获取相应模式菌中编码16S rRNA、RNA聚合酶β亚基蛋白(rpoB)、DNA促旋酶A亚基蛋白(gyrA)和组氨酸激酶(cheA)的核苷酸序列，比较其序列差异，以确定各看家基因在鉴定上述菌种中的作用，并明确在生产上鉴定相应近缘种的流程。然后以16S rRNA测序结合、、特异性引物扩增和系统发育树构建的方法鉴定了自主分离的19株生产可用的芽孢杆菌，验证了所提方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

本研究选取12株芽孢杆菌模式菌进行研究，将其名称、GenBank序列号、基因序列长度等相关信息整理于表1，上述信息主要在NCBI数据库检索得到。

供试的19株待鉴定芽孢杆菌分离株(依次命名为YC001～YC019),均分离自植物根际，具有分泌生长素、溶磷、拮抗病原菌等促生特性，被认定为微生物肥料生产的可用菌株。经初步的生理生化实验和16S rRNA基因分型鉴定，认为分属于巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等(表2)。

1.2 菌株基因组DNA模板制备

对待鉴定的19株芽孢杆菌分离株，挑取经平板活化的菌株单菌落于LB培养基中，37 ℃、180 r·min振荡培养8 h，按Genstar细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书的方法提取菌株基因组DNA，作为PCR模板。

1.3 特异性引物设计

从GenBank下载模式菌的相关序列，用Primer-BLAST程序设计引物(表3)并进行比对。每条引物均基于与本菌种同源而与其他菌种存在突变的区域设计，以保证其在相近种中同源性差异较大，其中，gyrA-bs和gyrA-ba引物仅能特异性扩增相应菌种。

1.4 分离株16S rRNA、rpoB、gyrA、cheA基因的PCR扩增

以19株分离株的基因组DNA为模板，用16S rRNA引物扩增所有菌株，用rpoB-bs、gyrA-bs、gyrA-ba引物扩增YC001～YC005菌株，用gryA-bc引物扩增YC006菌株，用cheA-bm引物扩增YC009～YC017菌株。反应体系为25 μL，包括PCR Mix预混液(含10×PCR缓冲液、dNTPs和聚合酶)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，25 ng基因组DNA(50 ng·μL)和10 μL无菌超纯水。PCR扩增程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环32次；72 ℃延伸10 min。最后，取3 μL PCR产物在1.5%(质量分数)琼脂糖凝胶上进行电泳。

表1 供试芽孢杆菌模式菌及其相关信息

表2 供试芽孢杆菌分离株的促生特性和来源

表3 特异性引物序列

1.5 模式菌株相关基因序列的相似性比较

通过NCBI数据库的Blast-N程序，对比模式菌之间16S rRNA、、、基因的序列一致性，确定不同基因在区分不同菌种上的应用。

1.6 分离株16S rRNA、rpoB、gyrA和cheA基因的系统发育分析

通过Blast-N比对19株分离株16S rRNA、、和基因扩增序列的同源性，用Lasergene软件中的SeqMan程序对芽孢杆菌分离株的扩增序列进行拼接，再使用Clustal W算法进行多序列比对，去除5′、3′末端的空序列，将所有序列修整为相同长度，最后利用Mega 7软件以邻接法构建供试分离株的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 rpoB、gyrA和cheA基因在芽孢杆菌鉴定上的应用

在菌株鉴定上，通常将3%的序列差异视为物种划分的阈值。从模式菌16S rRNA的序列一致性(表4)可以看出：多黏类芽孢杆菌ATCC 842、胶质芽孢杆菌3016与其他菌株的序列一致性分别为87.99%～89.17%和81.12%～88.57%，均低于97%，说明16S rRNA基因可以用于鉴定多黏类芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌。但16S rRNA基因的异质性，使其无法准确区分芽孢杆菌近缘种和部分亚种。例如：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌组和解淀粉芽孢杆菌组模式菌的16S rRNA基因序列具有98.06%～99.87%的同源性；蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌的16S rRNA基因序列同样具有极高的序列一致性。这说明16S rRNA基因无法将解淀粉芽孢杆菌组、枯草芽孢杆菌组的菌种，以及地衣芽孢杆菌进行精确区分，也无法区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌。

枯草芽孢杆菌组、解淀粉芽孢杆菌组所属菌种和地衣芽孢杆菌由于具有相似的表型和系统发育特征，被统称为“枯草芽孢杆菌复合体”。这3个种组之间基因的序列一致性均低于物种界定阈值(表5)，说明基因可用于区分这3个种组，但其组内亚种的基因序列一致性仍在97%以上。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的情况也是如此，说明无法用于区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，也无法鉴定解淀粉芽孢杆菌组和枯草芽孢杆菌组的亚种，这与前人的研究结果一致。但是，“枯草芽孢杆菌复合体”菌种间和基因序列存在明显差异(表6～7)，表明可以用和基因区分这几个菌种。另外，苏云金芽孢杆菌ATCC 10792与蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的基因序列一致性仅为94.54%，表明基因适用于区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。总体来说，除了巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌外，本文中其他近缘种都能用基因来区分，显示出该基因在芽孢杆菌鉴定上的优势。阿氏芽孢杆菌B8W22的全基因组测序项目仍在进行中，目前只能从NCBI数据库中获得该菌的16S rRNA基因和基因序列。阿氏芽孢杆菌B8W22与巨大芽孢杆菌ATCC 14581的基因的序列一致性为94.55%，这表明，基因可以用于区分巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌。同样地，除蜡样芽孢杆菌组以外，其他模式菌之间基因的序列一致性均低于97%，展现了基因在分子分型上的优势。

综上所述，应用、和基因鉴定芽孢杆菌的方法可总结为：(1)纯化菌株并提取基因组DNA；(2)根据产品标签注明的菌种信息，选择相应的引物(表8)进行PCR扩增；(3)根据产物扩增条带(和引物仅对相应菌种表现为阳性)、序列相似度和系统发育树确定菌种。

2.2 基于16S rRNA、rpoB、gyrA和cheA基因的分离株系统发育关系分析

根据Blast-N同源性比较的结果，菌株YC001、YC002、YC003、YC004、YC005与“枯草芽孢杆菌复合体”菌种的16S rRNA基因序列高度相似；菌株YC006的16S rRNA序列与蜡样芽孢杆菌组菌种的序列一致性也超过99%；YC009、YC010、YC011、YC012、YC013、YC014、YC015、YC016、YC017的16S rRNA基因与巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌的序列一致性都超过99%。由16S rRNA基因的序列一致性和构建的系统发育树(图1)可以看出：利用16S rRNA序列分析可将YC001、YC002、YC003、YC004、YC005分为枯草芽孢杆菌组和解淀粉芽孢杆菌组，但这些菌株与相应模式菌的亲缘关系非常近；YC006被鉴定为蜡样芽孢杆菌组；YC009、YC010、YC011、YC012、YC013、YC014、YC015、YC016和YC017被鉴定为巨大芽孢杆菌或阿氏芽孢杆菌。此外，YC019、YC008、YC018和YC007与大猩猩芽孢杆菌()和根内芽孢杆菌()、、德林芽孢杆菌()和诺瓦氏芽孢杆菌()、五大连池芽孢杆菌()和栗褐芽孢杆菌()、短短芽孢杆菌()和茹氏短芽孢杆菌()在16S rRNA基因上都有较高的序列一致性，由于目前数据库中仅有相应模式菌的16S rRNA基因序列，因此根据系统发育树上的遗传距离，将YC007鉴定为茹氏短芽孢杆菌，YC008鉴定为，YC018鉴定为五大连池芽孢杆菌，YC019鉴定为大猩猩芽孢杆菌。

表4 芽孢杆菌模式菌的16S rRNA基因序列一致性

表5 芽孢杆菌模式菌的rpoB基因序列一致性

表6 芽孢杆菌模式菌的cheA基因序列一致性

表7 芽孢杆菌模式菌的gyrA基因序列一致性

表8 鉴定菌种所用引物对应表

菌株YC001～YC006、YC009～YC017的16S rRNA序列高度相似，基于16S rRNA鉴定结果，根据表8所列引物，分别用rpoB-bs、gyrA-bs、gyrA-ba对YC001～YC005进行PCR扩增，用gyrA-bc对YC006进行扩增，用cheA-bm对YC009～YC017进行扩增，结果如图2所示。

基于基因构建的YC001～YC005的系统发育树(图3)与基于16S rRNA构建的系统发育树的趋势大体一致。从序列一致性来看：YC001与枯草芽孢杆菌的3个亚种均有超过97%的序列一致性，YC002、YC003、YC004和YC005与解淀粉芽孢杆菌组2个亚种的序列一致超过97%(表9)。基于序列一致性和系统发育树的一致性结果，将YC001鉴定为枯草芽孢杆菌组，将YC002、YC003、YC004和YC005归为解淀粉芽孢杆菌组。尽管在用基因构建的系统发育树上，这5个菌株都有与之亲缘关系相对更近的菌种，但分离株与其他物种间的一致性仍高于97%，因此需要用更准确的分型方法将其鉴定。

图1 芽孢杆菌分离株的16S rRNA系统发育树Fig.1 Rooted neighbor-joining tree generated using 16S rRNA nucleotide sequences of Bacillus isolates

M，DNA分子量标记；1，YC001；2，YC002；3，YC003；4，YC004；5，YC005；6，YC006；7，YC009；8，YC010；9，YC011；10，YC012；11，YC013；12，YC014；13，YC015；14，YC016；15，YC017。1， DNA marker; 1， YC001; 2， YC002; 3， YC003; 4， YC004; 5， YC005; 6，YC006; 7，YC009; 8， YC010; 9，YC011; 10， YC012; 11， YC013; 12， YC014; 13， YC015; 14， YC016; 15， YC017.图2 PCR扩增产物电泳结果Fig.2 Electrophoretic results of PCR amplified products

表9 分离株与枯草芽孢杆菌复合体模式菌的rpoB基因序列一致性

图3 基于rpoB基因构建的芽孢杆菌分离株的系统发育树Fig.3 Rooted neighbor-joining tree generated using rpoB nucleotide sequences of Bacillus isolates

用基因进一步确定YC001～YC006的分类。YC002、YC003、YC004和YC005与解淀粉芽孢杆菌DSM7的序列一致性均低于97%，但与贝莱斯芽孢杆菌FZB42的序列一致性分别为97.95%、98.11%、98.38%和98.54%，且这些分离株在用基因构建的系统发育树上与贝莱斯芽孢杆菌FZB42显示出比与解淀粉芽孢杆菌DSM7更紧密的关系(图4)，与用基因构建的系统发育树的结果一致。因此，将YC002、YC003、YC004和YC005鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，将YC001鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种。YC006的序列与苏云金芽孢杆菌ATCC 10792仅有92.91%的序列一致性，而与蜡样芽孢杆菌ATCC 14579有99.23%的序列一致性，因此将其鉴定为蜡样芽孢杆菌。

利用特异性引物扩增、分析YC009～YC017菌株的基因序列。结果显示，YC009、YC014和YC016分别与阿氏芽孢杆菌具有98.42%、97.97%和98.76%的序列一致性，而与巨大芽孢杆菌的序列一致性分别为94.06%、94.31%和94.29%(表10)。根据序列一致性，将YC009、YC014和YC016鉴定为阿氏芽孢杆菌。YC010、YC011、YC012、YC013、YC015、YC017与巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌基因的序列一致性均低于97%，无法准确鉴别。目前，阿氏芽孢杆菌B8W22的全基因组测序工作尚未完成，且关于巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌近缘种的研究相对较少，可能存在尚未报道的其他近缘种。因此，要准确鉴定上述菌株，还需要依赖全基因组测序工作的推进，以及今后对芽孢杆菌种质资源的持续挖掘。

图4 基于gyrA基因构建的芽孢杆菌分离株的系统发育树Fig.4 Rooted neighbor-joining tree generated using gyrA nucleotide sequences of Bacillus isolates

表10 分离株与相应模式菌的cheA序列比对结果

3 结论与讨论

芽孢杆菌最初是用表型特征，如细胞形状、内生孢子形成能力、运动性、溶血性等来进行分类的，然后再利用分子分型做进一步表征。然而，表型和遗传特性的相似性使得一些近缘种无法通过常规的生化测试和16S rRNA基因测序来区分。菌种鉴定的困难度，使得生产上出现质量不佳次品的概率较大，甚至会带来安全隐患。很多研究都强调了菌种鉴定在生产上的重要性，但这些研究大多集中在食品安全贮藏或益生菌行业。本研究主要针对微生物肥料中难以区别的常用芽孢杆菌，提出以3种看家基因(、和基因)作为16S rRNA基因分子分型的替代或补充的菌种鉴定方法，并用特异性引物扩增、鉴定了19株可用于微生物肥料生产的芽孢杆菌分离株。其中，基因编码的RNA聚合酶β亚基与DNA转录相关，基因编码的DNA促旋酶A亚基控制DNA超螺旋和复制起始，基因编码的组氨酸激酶是细菌趋化适应反应的调节剂，且有研究表明，基因与地衣芽孢杆菌的生物膜形成和控制有关。

为了保证结果的准确性，本研究检索了各菌种模式菌的16S rRNA、、和基因，并使用Blast-N算法和Mega 7软件进行序列比较分析。基于16S rRNA的序列一致性比较，仅鉴定出多黏类芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌，在进一步的研究中，看家基因弥补了16S rRNA基因的局限性，准确地区分了其他菌种。模式菌的基因序列差异表明，、和基因可作为系统发育的标记，用于区分枯草芽孢杆菌组和相关近缘种，和基因还可以准确地鉴定枯草芽孢杆菌组和解淀粉芽孢杆菌组的亚种。在类似研究中，、和基因已被用于追溯枯草芽孢杆菌组和解淀粉芽孢杆菌组之间的进化关系，基因还常被用于鉴定炭疽芽孢杆菌，追踪食品加工行业的蜡样芽孢杆菌污染。研究表明，基因不足以将蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌区分开，这与本研究的结果一致。但基因可用于鉴别蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，这弥补了基因在鉴定上的局限性。与基因相比，基因具有更高的区分度。本研究还发现，基因具有区分巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌的能力。

本研究利用不同的引物鉴定了19株具有促生效果的芽孢杆菌。通过16S rDNA序列的系统进化分析，鉴定了4株菌，分别为茹氏短芽孢杆菌、、五大连池芽孢杆菌、大猩猩芽孢杆菌；分析将另外4株菌鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，1株菌鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种，1株鉴定为蜡样芽孢杆菌，分析得出了相似的结果并支持该物种分类；基于基因序列差异将3株菌鉴定为阿氏芽孢杆菌；另外6株菌与巨大芽孢杆菌和阿氏芽孢杆菌的序列一致性均低于97%，暂时无法准确区分。