干酪用乳酸菌的特性比较及新鲜干酪的制作

陈森怡，刘振民，焦晶凯，庞佳坤，余 意

（1.乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306）

乳酸菌是革兰氏阳性、非孢子型细菌，可以将碳水化合物发酵成乳酸。乳酸菌是属于基因多样性的细菌，包括杆状细菌：如乳酸杆菌；球菌：如链球菌、乳球菌、肠球菌、小球菌或明串珠菌等[1]。乳酸菌已在食品发酵方面使用多年，如干酪、酸奶等乳制品。乳酸菌在干酪的制作中占有极其重要的角色，诸如水解乳糖快速产酸、蛋白水解和脂肪分解极大地促进了风味及质地的发展[2-3]。

干酪的结构性质通常用质构以及流变学性质表观。干酪质地受决定结构因素的影响，如牛乳成分、水分含量、pH值和蛋白水解程度等[4]。流变学是压缩、剪切等过程中应力或者应变的响应[5]。目前有很多关于奶酪结构影响因素的研究，如蛋白质脂肪的含量[6]、凝乳酶类型[7]、凝乳的方式[8]、贮存方式[9]等。

新鲜干酪是指生牛乳、稀奶油、乳清粉或者其混合物经过添加干酪发酵剂、凝乳酶而形成凝块的产品，它未经成熟或者成熟期极短，由于其质地柔软、口味清淡爽口、含水量较高，易被我国消费者所接受，因此在国内日益受欢迎[10]。但目前很多特色的干酪依旧不为国人所接受，因此考虑从中国盛产干酪的地区开发出一些的特色菌株用于干酪生产，由此改善干酪的质量以及安全性。

本研究从新疆、云南、西藏等地采取的干酪样品中分离出的多株乳酸菌中，选取7 株具有代表性特色菌株进行发酵性能的评估，并应用于新鲜干酪中，从质构和动态流变学上进行分析，筛选出适合新鲜干酪制作的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干酪制作中的生牛乳原料取自光明乳业股份有限公司；筛选菌株来自光明乳业股份有限公司：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）E11、C44，瑞士乳杆菌（L. helveticus）G12，干酪乳杆菌（L. casei）D41，副干酪乳杆菌（L. paracasei）B1，肠球菌（Enterococcus faecium）F22、N，从新疆、西藏、云南奶酪中分离获取；CHOOZITTMMA14菌株 丹麦科汉森公司；凝乳酶Marzyme 中国Danisco公司。

MRS肉汤培养基 英国Oxoid公司；L-亮氨酸对硝基苯胺、对硝基苯胺、Tris-HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HVE-50高压蒸汽灭菌锅 日本Hirayama公司；奶酪槽 英国Armfiled公司；高压均质机 丹麦APV公司；三合一pH计 德国赛多利斯公司；BROOKFILED-DVII＋黏度计 美国博勒飞公司；Mb45水分测量仪 美国Ohous公司；SCIENTZ-IID细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；5417R离心机 德国Ependorf公司；SPECORD紫外-可见分光光度计 德国Analytik Jena AG公司；ARES-G2流变仪美国TA仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化

取少量冻存管的菌种接种于5 mL新鲜MRS肉汤培养基中，放于30 ℃的培养箱中培养，观察菌体沉淀，有沉淀产生后，按2%～3%接种量接种于新鲜MRS肉汤培养基中活化第2代，依次活化2～3 代。

1.3.2 产酸性能测定

将活化好的7 株菌均以3%接种量分别接种在无菌脱脂乳中，培养温度为30 ℃，培养24 h后测定发酵乳pH值，计算ΔpH值，即ΔpH值为发酵0～24 h之间的变化值。

1.3.3 产黏能力的测定

将7 株菌株分别以3%的接种量接种在100 mL 12 g/100 mL的无菌脱脂乳培养基中，30 ℃培养至全部凝乳，记录凝乳时间并测定各组发酵乳黏度，黏度测定参数设置：选择转子LV 2，转速64 r/min，测量时间1 min。每隔10 s测定1 次，测定3 次并计算黏度平均值。

1.3.4 自溶度的测定

参考Al-Saleh等[11]的方法进行部分修改，分别将7 株菌进行活化传代，按3%的比例接种在MRS肉汤培养基中，在30 ℃恒温培养箱中培养至对数期；将菌体4 ℃、9 000 r/min冷冻离心15 min，取离心获得的菌体（沉淀）重悬浮于50 mmol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液中，洗涤2～3 次，使菌液在波长650 nm处的吸光度在0.7～0.8之间。将菌体悬浮液置于30 ℃继续培养24 h，在650 nm波长处测定24 h前后吸光度的变化。用磷酸盐缓冲液作为空白对照。菌株自溶度按式（1）计算：

式中：At为菌悬液24 h后吸光度；A0为菌悬液初始吸光度。

1.3.5 氨肽酶活力的测定

1.3.5.1 菌体的培养

分别将各菌株的冻干粉连续活化3 代，按照2%～3%接种量接种于新鲜的MRS肉汤培养基中，在30 ℃培养至对数期，9 000×g、4 ℃离心20 min弃上清液取沉淀。利用pH 8.0、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液重复洗涤2～3 次，收集菌体，4 ℃备用。

1.3.5.2 无细胞粗提物的制备

参考张咚咚[12]和郭宇星等[13]方法略作修改。将上述菌液进行超声破碎，超声功率300 W，超声时间27 min，工作时间5 s，间隔时间3 s。超声破碎后，10 000×g、4 ℃离心15 min，取上清液即为粗酶液。

1.3.5.3 酶活力测定

参考张咚咚[12]和郭宇星等[13]方法略作修改。等量粗酶液进行相同倍数稀释，取稀释菌液0.5 mL加入至5 mL的Tris-HCl缓冲液中，在40 ℃的水浴中预热5～10 min，加入25 mmol/L的L-亮氨酸对硝基苯胺溶液0.5 mL，40 ℃准确反应30 min，之后立即放入冰水中待冷却后，在波长410 nm处测定吸光度，以去离子水代替酶液作为对照组。氨肽酶活力定义：在40 ℃条件下，pH 8.0时，每分钟生成1 μg对硝基苯胺所消耗酶量为1 个酶活力单位值。

对硝基苯胺标准曲线的绘制：配制1～6 μg/mL系列质量浓度的对硝基苯胺溶液，在410 nm波长处测定吸光度，以对硝基苯胺质量浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制标准曲线。

氨肽酶活力计算如式（2）所示：

式中：V为反应的总体积/mL；ΔA为空白组与实验组的吸光度之差；M为稀释倍数；t为反应时间/min；v为酶液体积/mL；K为消光系数0.036 8。

1.3.6 新鲜干酪的制作

参考焦晶凯等[14]方法进行部分修改。取5 kg的无抗生牛乳，放入水浴锅预加热，加热至60～65 ℃进行高压均质，均质压力18 MPa，牛乳均质后进行巴氏杀菌（90 ℃、5 min），在冰水中进行冷却，冷却至30 ℃左右进行接种，接种比例3%，接种后搅拌均匀，静置初发酵30 min，在pH值降0.2左右加入凝乳酶，轻微搅拌均匀后放置在30 ℃培养箱中发酵过夜，切割凝乳1 cm×1 cm，加热至65 ℃，排除乳清，冷却至40 ℃，吊袋过夜，包装，4 ℃贮存备用。

1.3.7 干酪基本理化指标的测定

蛋白质含量的测定：参考GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法；脂肪含量的测定：参考GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》索氏提取法；水分含量的测定：采用mb45水分含量测定仪；pH值的测定：取预先放置在4 ℃保存的样品10 g置于研钵中，研磨混匀，用pH计直接插入测定。

1.3.8 干酪质构的测定

使用TA.XT plus质构仪，采用一下压方式，参数设置为测试前速率1 mm/s、测试速率3 mm/s、回程速率10 mm/s、触发力1 g、测试时间5 s、测试探头类型HDP/SR。测试前样品装入磨具磨平，放入4 ℃冰箱冷藏30 min，所有样品在5 min内测试完毕，每个样品平行测试3 次。

1.3.9 动态流变的测定

1.3.9.1 线性黏弹区的确定

结合Rosenberg[15]和Tunick[16]等方法进行干酪流变测试，使用ARES-G2流变仪，夹具类型为50 mm不锈钢圆形平板，平板与测试台距离设置为1 mm，测定温度20 ℃，应变扫描范围0.01%～10%，通过对数扫描确定恒定的振荡应变区为线性黏弹区。

1.3.9.2 动态流变测定

在20 ℃条件下，根据以上线性黏弹区所确定的应变值0.025%，GAP设置为1 mm，在0.1～100 rad/s范围内频率扫描。绘制扫描频率为横坐标（采用对数刻度），损耗（黏性）模量G’、贮能（弹性）模量G’、复合黏度η*为纵坐标的流动曲线。

1.4 数据分析

采用Excel 2010对实验数据进行绘图，IBM SPSS Statistics 21软件进行ANOVA、相关性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株在脱脂乳中的产酸性能分析

选择干酪所用菌株时，产酸率是筛选的关键。在干酪加工中乳酸菌发酵分解牛乳中的乳糖而产生乳酸，乳酸的产生有利于凝乳酶发挥作用，其次增加酪蛋白中钙组分的溶解；最后酸化程度影响凝块的硬度大小及风味特色[17]。产酸速度影响干酪生产制作中牛乳的预酸化时间[18]。

图1 不同菌株发酵24 h的产酸性能Fig. 1 Acid production after fermentation of skim milk with different strains for 24 hours

从图1可以看出，不同菌株在发酵24 h后在产酸性能表现出一定差异（P＜0.05），整体上乳酸乳球菌的产酸速率较快且产酸量高，菌株E11的ΔpH（2.23±0.02）稍大于C44（2±0.01），但是两者之间的差异并不显著（P＞0.05）；其次是G12、N、F22、B1，后三者在产酸方面无显著性差异；而D41的产酸性能最低。因此产酸方面可以考虑E11、C44、G12，其他产酸性能较低的菌株，后续可以通过复配产酸性能好的菌株进行使用。

2.2 菌株产黏性能分析

图2 不同菌株的产黏性能Fig. 2 Viscosity production of different strains

乳酸菌的产黏性能对干酪的结构、组织状态、质地有一定影响[19]。由图2可以看出，乳酸菌发酵脱脂乳产生的发酵乳黏度在（0.125±0.002）～（0.351±0.023）Pa·s之间，其中C44和B1黏度无显著差异（P＞0.05），且黏度值显著高于其他组，其次是E11、N，黏度值分别为（0.264±0.019）、（0.209±0.054）Pa·s，其余菌株发酵乳的黏度值均在0.200 Pa·s以下，其中D41表现出的黏度值最低，其值为（0.125±0.002）Pa·s。很多研究表明乳酸菌黏度的表现与其产生的胞外多糖有关，张丽[20]研究发现发酵乳的黏度与胞外多糖存在显著相关性，而且胞外多糖含量和种类对发酵乳的黏度均有一定的影响，在一定范围内，胞外多糖含量越高发酵乳黏度越大[20]，但是含量过高会影响干酪的持水性，因此可以根据生产干酪类型的差异选择不同特性的乳酸菌。

2.3 菌株的自溶度分析

自溶是细胞中称为自溶素的肽聚糖水解酶对细胞壁肽聚糖的酶促切割[21]。Law[22]研究发现未成熟干酪中的发酵剂自溶度与蛋白水解呈正相关。在干酪生产过程中，乳酸菌的自溶会释放胞内蛋白酶、肽酶、脂肪酶分解蛋白质、多肽、脂肪，从而加快干酪的成熟，改善干酪的风味及硬度及流变性质[19]，并节约成本。

图3 不同菌株的自溶度特性Fig. 3 Characteristics of autolysis of different strains

从图3可以看出，不同菌株自溶度有显著差异（P＜0.05），其中D41的自溶度高达44.75%，高自溶裂解释放出更多蛋白酶加速了体系中蛋白质的分解，产生更多水溶性成分，功能性小肽、游离氨基酸，而酪蛋白原本的凝胶网状结构被破坏，干酪体系变得松散，从而一定程度上使得干酪的硬度下降[23]，此外这些水溶性分子间形成更多的连接键，重建较小的网络结构，利于干酪保持一定的弹性[24]，而且也可使干酪进入肠胃中更易被消化吸收。E11的自溶度仅次于D41，自溶度为32.39%，其余5 株菌的自溶度在15.33%～25.7%之间，其中F22的自溶度处于最低水平。选择自溶度适中菌株更易获得高水平的干酪。高自溶度的菌株可以加快蛋白质的分解，更加适用于成熟干酪成熟期的应用，从而缩短干酪成熟期[11]，高自溶活性的菌株加速干酪风味的形成，但过高的自溶度会导致苦味肽、己醛等不良成分的形成，不利于干酪的风味，对干酪的硬度产生一定影响[23]。因此用于干酪生产的菌株选择自溶度适中，既保证了一定的蛋白质水解，也对干酪风味质地产生一定贡献。

2.4 菌株氨肽酶活力分析

干酪中蛋白质水解有蛋白酶、纤溶酶、肽酶等的参与，其中肽酶中的氨肽酶能够降解疏水性的肽组分减轻干酪苦味[25]，小肽分子和游离氨基酸是风味物质的前体成分。

图4 不同菌株的氨肽酶活力Fig. 4 Aminopeptidase activities of different strains

氨肽酶中具有代表性的是亮氨酸（Leu）氨肽酶，通过超声破碎法获取酶液，其活力测定结果如图4所示，所有乳酸菌菌株均表现出对L-亮氨酸-4-硝基苯胺的氨肽酶活力；其中氨肽酶活力最高的是C44，其值为15.9 U/mL，其次为E11（12.30 U/mL）、D41（9.35 U/mL）、B1（6.88 U/mL）、F22（5.95 U/mL）、G12（5.42 U/mL），N具有最低的酶活力3.16 U/mL，与其他菌株存在显著性差异（P＜0.05）。其中D41具有较高自溶度外，还具有较高的氨肽酶活力，已有研究表明，乳酸菌自溶性较大，干酪中蛋白质的次级降解程度越大，游离氨基酸水平越高，因此菌株的自溶程度与氨肽酶相关的次级分解之间有一定正相关关系[26-27]。较高的自溶度、氨肽酶活力使蛋白质分解程度高，促进产生更多风味相关物质，且干酪的酪蛋白凝胶结构被破坏从而使干酪硬度下降而变软[28]。

2.5 新鲜干酪基本指标的测定结果

水分含量和水分活度是评价干酪在贮藏期间稳定性的重要依据，水分含量是干酪尤其是新鲜干酪贮藏的一个至关重要的特征，另外水分含量与干酪的硬度有极大相关性，直接决定了产品的质地，水分含量较高的干酪，质地较软，但是贮存期较短，生产中根据产品类型的不同控制其水分含量，以达到产品品质的要求。

表1 不同菌株的干酪理化数据结果Table 1 Physicochemical properties of cheeses made with different strains

由表1可知，E11、C44菌株所制干酪水分含量与对照组接近且无显著性差异（P＞0.05），水分活度较低于对照组；F22、N所制干酪的水分含量显著低于对照组（P＜0.05），但是水分活度与对照组并无显著性差异（P＞0.05）。不同菌株的添加导致干酪中蛋白质、脂肪含量的显著差异（P＜0.05）。

2.6 新鲜干酪质构分析

表2 不同菌株的干酪质构分析Table 2 Texture characteristics of cheeses made with different strains

表3 相关性分析Table 3 Correlation analysis

图5 11菌株所制干酪的质构典型曲线Fig. 5 Typical texture curve of cheese prepared with strain E11

由表2所示，不同特性菌株制作的干酪在质构上存在显著性差异。其中E11、C44、G12菌株所得干酪在硬度、涂抹性、黏聚力、黏着性与对照组表现相近，更加适用于新鲜干酪的制作，其中F22、N的质构表现与对照组相差较大。D41、B1与对照组相比处于中间水平。E11菌株所制干酪的质构典型曲线见图5。根据表3相关性分析数据，菌株的产酸特性影响干酪持水性，体现在对干酪中水分含量以及水分活度的影响；水分含量的控制不仅与pH值相关[29]，也有研究表明与工艺参数[30]、巴氏杀菌的方式、压榨程度相关[31]。如表3所示，干酪的水分含量与干酪的硬度、涂抹性呈极显著负相关，与黏着性、黏聚力呈极显著正相关，且硬度与涂抹性呈极显著正相关，与黏聚力、黏着性呈极显著负相关。水分含量对质构的影响显著性高于水分活度、蛋白质、脂肪含量对质构的影响。此外硬度是干酪的一个至关重要的功能特性，干酪中的蛋白质基质所形成的空间结构体现了干酪的硬度[32]，于华宁等[33]研究提到干酪的硬度一般由非脂物质决定，硬质干酪的非脂物质均显著高于软质干酪，故硬度偏大，该结论与本研究结论一致，干酪中蛋白质与干酪的硬度呈极显著正相关。另外自溶度、氨肽酶活力不同的菌株，在蛋白酶、脂酶等表现的不同，在硬度上存在一定的差异；菌株自溶度、氨肽酶活力高使得蛋白质和脂肪发生水解其结构发生变化，有研究表示随着蛋白质水解程度越大，干酪的硬度、弹性呈下降趋势[34]。

2.7 新鲜干酪动态流变分析

干酪是黏弹性的物质，既包括固体性质（弹性），又包括液体性质（黏性），其中G’代表物质材料贮存能量（弹性模量），损耗模量（黏性模量）G’代表每一个循环能量的损失[35]。如图6所示，在20 ℃条件下，复合黏度η*随扫描频率的增加而降低，而G’和G’随着扫描频率的增加而增加。在0.1～100 rad/s频率范围扫描下，所有干酪的G’都显著高于G’，且无相交点，η*逐渐下降，且所有干酪的tanδ均大于0.1（G’与G’的比值），表明干酪均表现为弱凝胶或者固体性质[36]；此外分子间以及分子内部作用也可能导致了酪蛋白颗粒的融合进而促使了该类型结构的形成[37-38]。从图6B、C可以看出，水分越高的干酪，其黏弹性越低，使用D41菌株制作的干酪的G’和G’均大于其他菌株干酪，说明D41干酪的流变性质相较于其他的菌株干酪固体的形态更显著，这与质构测试中的较高硬度、涂抹性相对应，该菌株可能更适用于硬质干酪的制作。可以看出，干酪的黏弹性结果与硬度的大小存在一定关联性，此结论与于华宁[33]和Garcia[39]等结论一致。

图6 不同菌株制作的新鲜干酪在20 ℃的η*（A）、G”（B）和G’（C）Fig. 6 Complex viscosity (A), loss modulus/viscosity modulus (B) and storage modulus/elastic modulus (C) of fresh cheeses made with different strains at 20 ℃

3 结 论

乳酸乳球菌E11、C44在0～24 h产酸快、产黏适中，自溶度和氨肽酶活力较高，在以上方面均表现较优异。在质构上，菌株自溶度和氨肽酶活力较高的菌株释放更多的蛋白酶和脂酶水解蛋白质和脂肪，使干酪表现为低硬度，如E11、C44。经过相关性分析得出，水分含量与干酪硬度呈极显著负相关，水分越高的干酪，硬度越低，黏着性越高；此外干酪的pH值、蛋白质、脂肪含量也对干酪的质构有显著正相关性。在动态流变分析中，7 种新鲜干酪的G’随着扫描频率的增加始终大于G’，tanδ＞0.1，即干酪的弹性属性占主导地位，其中菌株E11、C44所制干酪在黏弹性均接近于对照组。综上总结分析乳酸乳球菌E11、C44可考虑用于新鲜干酪发酵剂的备用，其他菌株根据特性不同后续可以通过复配进行发酵生产高功能性、高品质的干酪。