解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解及生物活性的影响

赵 笑，蔡 淼，杨智杰，罗天淇，陈 超，曹永强，杨贞耐,,

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048；2.东君乳业（禹城）有限公司，山东 德州 253000）

凝乳酶是干酪制作过程中促使牛乳凝固的关键蛋白酶。随着乳制品行业干酪产量的日益增长，凝乳酶的需求量不断增加，但是传统动物来源的凝乳酶价格昂贵，且由于宗教或饮食原因，其应用受到一定程度限制。获得天然高效的新型凝乳酶成为干酪产业新的挑战[1-2]。微生物凝乳酶具有来源广、易于获得、成本低等优点，是当前凝乳酶研发的热点[3]。

与动物来源的凝乳酶相比，微生物凝乳酶通常具有相对较高的蛋白水解活性，并对不同酪蛋白组分表现出不同的水解特异性[4]。干酪成熟过程中伴随着蛋白水解作用导致小肽和游离氨基酸的不断积累，可产生香气化合物和生物活性因子，对干酪的风味、功能和质地都有影响[5]。通过调控蛋白水解，可以改善干酪的感官和品质特性，加快干酪的成熟。干酪成熟过程中的蛋白水解分为初级蛋白水解和次级蛋白水解；初级蛋白水解是由干酪中残留的凝乳酶或者其中存在的其他蛋白酶引起的酪蛋白（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白）的降解，对干酪品质起着重要作用[6]。干酪初级和次级蛋白水解的程度因凝乳酶和发酵剂的热失活程度而有很大的不同[7]。不同来源微生物凝乳酶的蛋白水解特性不同，导致干酪成熟过程中蛋白水解程度的差异，对干酪品质产生不同的影响[8-9]。Ahmed等[10]研究表明产自嗜热脂肪芽孢杆菌的凝乳酶具有良好的热稳定性和pH值稳定性，使用这种酶生产的软质干酪与用商业混凝剂生产的同类产品具有相似的理化性质和风味特征，但是前者感官质量较低。此外，使用解淀粉芽孢杆菌和芽孢杆菌spp. P45凝乳酶制作的干酪均表现出较高的蛋白质水解并形成小分子肽，使干酪偏软[3]。

酪蛋白酶解可释放特定序列的肽并具有不同的生物活性，包括抗氧化、降血糖、抗菌、抗炎和免疫调节等活性[11]。近年来微生物凝乳酶在切达干酪中的应用侧重于研究干酪成熟过程中的蛋白水解对风味及感官特性的影响，而对于成熟期干酪因蛋白降解导致的干酪生物活性变化的研究不多。本实验室此前从制作江米酒的酒曲中筛选到1 株产凝乳酶的菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌GSBa-1[12]，该菌株产的凝乳酶具有高效凝乳活性且具有一定的蛋白水解能力，该凝乳酶应用于马苏里拉干酪可促进成熟过程中风味物质的形成[13]。本研究探讨GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解的作用及其与干酪生物活性之间的关系，通过控制微生物凝乳酶的蛋白水解改善切达干酪的生物活性，旨在进一步了解微生物凝乳酶对干酪成熟特性和生物活性的影响及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳（pH 6.68，蛋白3.42%，脂肪4.50%），购自北京市半截河奶牛场；商业发酵剂R701、商业凝乳酶CHY-MAX Powder Extra NB 丹麦科汉森股份有限公司；干酪制作中所需氯化钠和氯化钙均为食品级；微生物凝乳酶为本实验室解淀粉芽孢杆菌GSBa-1发酵分离纯化得到[14]；考马斯亮蓝色R250 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

RHEOLASER MASTER微流变仪 法国Formulaction公司；Kjeltec 8400凯氏定氮仪 丹麦Foss分析仪器公司；Mini-Protean PowerPac Basic蛋白电泳系统、全自动凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Ultra-TurraxT25匀浆器 德国IKA公司；CR21GIII冷冻离心机日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 微流变测定

微流变仪是基于扩散波光谱学方法对样品进行测量。乳液样品集中介质中的动态光散射和粒子的布朗运动依赖于其黏弹性的结构。本实验对加入不同凝乳酶的牛乳样品以及添加钙离子和未添加钙离子的样品进行6 h的微流变学检测，温度设定为35 ℃，检测过程中每6 min进行一次数据采集，即测定弹性因子和黏性因子。该仪器通过测定粒子的布朗运动作为粒子均方位移与时间的关系，从而获得样品的弹性指数和黏性指数。

1.3.2 干酪制作

参考Zhang Li等[15]的方法，从当地奶牛场购买的生牛乳用于制作切达干酪。采用相同批次的生牛乳（36 L），制作3 组干酪，每组3 个平行样品（4 L生乳/样品）。干酪A、干酪B和干酪C分别由商用凝乳酶、商业凝乳酶70%＋GSBa-1凝乳酶30%、GSBa-1凝乳酶制成。制作过程如下：将发酵剂（体积分数1.5%）添加到经过巴氏杀菌（65 ℃、30 min）牛乳中，搅拌均匀，33 ℃发酵30 min，然后加入氯化钙（0.005 g/100 mL）和凝乳酶（1 500 SU/L），待45 min凝固（33 ℃）。将凝乳切成2 cm3大小的立方体，静置10 min后，升温至39 ℃，直到pH值降至6.1～6.2，此时完全排除乳清。乳清排出后，将凝块切碎搅拌至pH值为5.4～5.5，研磨，加入食盐量为2.7%（质量分数），装入磨具，压模过夜，压好的干酪进行真空包装。干酪在4 ℃成熟12 周。干酪成熟过程中分别取0（第1天）、1、2、3、4、8、12 周样品测定各项指标。

1.3.3 干酪理化指标测定

干酪得率计算如式（1）所示：

参考文献[16]凯氏定氮法测定干酪蛋白质含量；根据GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》的方法测定干酪脂肪含量；根据GB 5009.44—2016《食品中氯化物的测定》的方法测定干酪盐含量；根据GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》的方法测定干酪水分含量。

pH值测定：取干酪样品10 g，磨碎后加入事先于50 ℃温浴的蒸馏水12 mL，用Ultra-Turrax匀浆器处理1 min，将样品充分匀浆，放置在50 ℃水浴中保温处理30 min，而后于6 000×g、20 ℃离心15 min，倒掉脂肪层，取下层溶液测定pH值。

微生物指标的测定：取各成熟阶段的干酪样品5 g加入到45 mL灭菌的生理盐水（40 ℃）中，匀浆处理2 min将样品充分匀浆，然后逐级稀释至10－5。挑取适当稀释度涂布于事先倒好的M17琼脂平板上，培养2～3 d后对乳酸乳球菌进行计数。

1.3.4 蛋白水解特性分析

1.3.4.1 蛋白水解活力测定

参照张富新[17]的福林-酚法。采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）将酶失活并沉淀非水解蛋白。1 个单位的蛋白水解活力定义为：40 ℃条件下，1 min内催化酪蛋白水解产生1 μg酪氨酸所需酶量。

1.3.4.2 pH 4.6可溶性氮和12% TCA可溶性氮含量测定

根据Kuchroo等[18]的方法，并略有改动。准确称取干酪样品20 g，磨碎后加入40 mL 50 ℃的无菌蒸馏水，充分匀浆，然后将溶液pH值调至4.6，置于40 ℃水浴中保温1 h。并于6 000×g、20 ℃条件下离心15 min，过滤除去上层脂肪，并将滤液定容至100 mL。取10 mL滤液消化后，凯氏定氮测定样品中的氮含量[19]。

量取1 0 m L 上述p H 4.6 可溶性氮溶液，加入10 mL 12%的TCA，充分混匀后于室温条件下放置1 h，在6 000×g、20 ℃条件下离心15 min。取10 mL消化，凯氏定氮测定样品中的氮含量。

1.3.4.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

SDS-PAGE分析参照Laemmli[20]的方法。浓缩胶4.5%，分离凝胶12.5%，0.01 g/100 mL考马斯亮蓝色R250染色，脱色处理后，采用全自动凝胶成像系统观察。

1.3.5 干酪生物活性测定

1.3.5.1 金属离子螯合能力

参照Wang Xu等[21]的方法并略有改动。分别在不同成熟阶段的样品肽溶液（按1.3.4.2节方法得到的pH 4.6可溶性蛋白溶液，经过0.22 μm滤膜）中加入相同体积的氯化钙或氯化锌（0.25 mol/L）。然后将溶液在45 ℃、80 r/min水浴摇床中孵育1 h，充分反应。最后，将肽螯合物加入9 倍体积的乙醇，6 000 r/min、4 ℃离心沉淀15 min，上清液用于进一步测定螯合能力。

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）显色滴定法测定钙离子螯合能力。分别测定多肽和钙混合溶液中钙总含量以及除去钙离子螯合物后剩余上清液中的钙含量。在反应混合物中加入指示剂铬黑T后，调整至pH 10.5，再用EDTA-Na2溶液（25 mmol/L，pH 10.5）对溶液进行滴定，直至溶液的颜色由紫红色变为蓝色，根据EDTA消耗量，计算螯合比。钙离子螯合能力计算如式（2）所示：

式中：M0为混合液中钙总含量；M1为上清液中钙含量。

锌离子螯合能力测定方法与钙离子螯合相同，其不同之处为使用氯化锌与多肽螯合，螯合能力指示剂使用二甲酚橙，调整至pH 5.5～6.5，再用0.025 mol/L EDTA溶液（pH 6.0）对溶液进行滴定，直至溶液的颜色由紫红色变为橙黄色。

1.3.5.2 降血糖作用

对α-淀粉酶抑制作用测定：参考Eleazu等[22]的方法进行。25 μL样品多肽溶液与25 μL 0.5 mg/mLα-淀粉酶（溶于20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.9））溶液混合，25 ℃反应10 min，然后加入25 μL含0.5%淀粉的20 mmol/L磷酸盐缓冲液，25 ℃反应10 min，加入50 mL 96 mmol/L二硝基水杨酸显色剂终止反应，反应混合物在沸水浴中煮沸10 min，室温冷却，测定在540 nm波长处的吸光度，空白用蒸馏水代替多肽溶液，α-淀粉酶抑制率计算如式（3）所示：

对α-葡萄糖苷酶抑制作用测定：5 μLα-葡萄糖苷酶溶液（1.0 U/mL）、20 μL样品多肽溶液与165 μL 0.1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8）混合，在96 孔板中37 ℃放置10 min，然后加入底物10 μL（含0.95 mmol/L对硝基苯-葡萄糖苷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH 6.9），继续37 ℃放置10 min，加入100 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应。用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度。并与4 个对照组比较（A：缓冲液＋酶＋底物＋Na2CO3；B：缓冲液＋Na2CO3；C：缓冲液＋酶＋样品＋底物＋Na2CO3；D：缓冲液＋酶＋样品＋Na2CO3）。α-葡萄糖苷酶抑制率计算如式（4）所示：

式中：A、B、C、D分别表示A、B、C、D组的吸光度。

1.3.5.3 抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力测定参考Zhang Fang等[23]方法并有所改动。取0.5 mL干酪样品肽溶液，与1 mL 0.2 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-甲醇溶液混合均匀，室温下避光反应1 h，离心取上清液，于517 nm波长处测定吸光度。空白组以等体积甲醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替。DPPH自由基清除率计算如式（5）所示：

式中：A为空白组的吸光度；A0为对照组的吸光度；A1为样品组的吸光度。

2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力测定采用ABTS测定试剂盒，ABTS阳离子自由基吸光度测定波长为734 nm或405 nm。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶作用下凝乳过程的流变学特性

图1 牛乳在不同凝乳酶作用下凝乳过程的流变学特性Fig. 1 Rheological behavior during milk coagulation by different milk-clotting enzymes

前期研究表明GSBa-1凝乳酶为中性蛋白酶[13]，为探究该凝乳酶作用下的凝乳特性及蛋白水解变化，使其更好地应用于干酪生产，选择商业凝乳酶和商业芽孢杆菌中性蛋白酶对比GSBa-1凝乳酶在牛乳凝固过程中的流变学特性。如图1A、B所示，加入GSBa-1凝乳酶的牛乳在整个凝乳过程中的黏弹性变化与商业凝乳酶更为接近，黏性显著高于中性蛋白酶形成的凝乳。由图1C可知，氯化钙的加入使GSBa-1凝乳酶和商业凝乳酶的凝乳位点向前移动，加快凝乳，缩短凝乳时间，提高凝乳后的弹性和黏性。加入中性蛋白酶的牛乳快速凝乳后凝乳结构又迅速瓦解，整个过程中的黏性都很低（图1D），且氯化钙的加入使其弹性也迅速降低，表明该酶由于强烈的蛋白水解作用，不适用于干酪加工。而GSBa-1凝乳酶与商业芽孢杆菌中性蛋白酶不同，前者表现出更好的凝乳特性和较低的蛋白水解特性，可用作凝乳酶代替或者部分代替商业凝乳酶用于切达干酪的制作。

2.2 切达干酪的理化指标分析

2.2.1 干酪基本理化指标

表1 切达干酪的主要组成指标比较Table 1 Comparison of main components of Cheddar cheeses

由表1可知，不同实验组成品切达干酪的干酪得率、总蛋白含量、脂肪含量以及氯化钠含量之间无显著差异（P＞0.05）。说明GSBa-1凝乳酶对切达干酪的主要组成成分没有明显影响。

2.2.2 切达干酪成熟过程中的pH值、水分及微生物变化

干酪的pH值取决于发酵剂乳酸乳球菌的生长繁殖、乳清排出时的酸碱度以及含盐量[24]。由图2A可知，整个干酪成熟过程中，3 组干酪的pH值呈现上升的趋势，pH值大小为干酪A＞干酪B＞干酪C。 由于干酪制作过程中乳清排出时的pH值保持一致，干酪初始氯化钠含量没有明显差异，因此，干酪C pH值显著降低表明GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用可以使发酵剂的代谢活动增强，产酸能力增加。由图2B可知，干酪A和干酪B的水分含量有所升高，干酪C水分含量则明显升高，且显著高于干酪A和干酪B（P＜0.05），可能由于干酪C中GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用，使得干酪蛋白结构部分破坏，部分结合水转化为自由水，同时也影响了干酪的保水能力[25]。切达干酪成熟过程中，乳酸乳球菌的生存环境发生变化，部分菌发生自溶，使得3 组干酪的乳酸乳球菌数均逐渐下降，如图2C所示，干酪C中的乳酸乳球菌数由9.77（lg（CFU/g））显著下降至5.08（lg（CFU/g）），干酪成熟4 周后，干酪C的微生物乳酸乳球菌数迅速下降，显著低于干酪A，干酪B乳酸乳球菌含量则介于干酪A和干酪C之间。干酪C较高的水分及pH值的迅速降低使乳酸乳球菌的自溶率增加，乳酸菌含有胞外及包内多种蛋白酶，乳酸乳球菌的死亡，有助于胞内酶的释放[26]。

图2 切达干酪成熟过程中p值（A）、水分含量（B）和活菌数（C）变化Fig. 2 Changes in pH (A), moisture (B) and viable bacterial count (C) of Cheddar cheeses during ripening

2.3 切达干酪成熟过程中的蛋白水解作用

2.3.1 GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解活性的影响

图3 切达干酪成熟过程中蛋白水解活力的变化Fig. 3 Changes in proteolytic activity of Cheddar cheeses during ripening

如图3所示，干酪成熟过程中，干酪A和干酪C的蛋白水解活力趋势相接近，在1 周之内先分别上升至4.20 U/g和3.33 U/g，超过1 周之后缓慢下降并趋于平稳。干酪C的蛋白水解活力则是在干酪成熟2 周之内先上升至8.02 U/g，后到成熟第12周逐渐下降至2.59 U/g。干酪C的蛋白水解活力始终显著高于干酪A和干酪B。

为进一步探究GSBa-1凝乳酶作用下干酪蛋白的水解变化，将3 组干酪不同成熟期的蛋白应用于SDS-PAGE，结果如图4所示。干酪A 0～12 周成熟过程中蛋白条带变化清晰，副κ-酪蛋白由商业凝乳酶切断κ-酪蛋白的Phe105～Met106之间的肽键而产生，其蛋白条带在10～15 kDa之间，存在于整个成熟过程，且未发生任何变化。α-酪蛋白条带逐渐变窄，主要生成了位于下方的两条清晰可见的蛋白条带，而β-酪蛋白的变化不明显。干酪B中蛋白条带的变化与蛋白A接近。干酪C则在成熟过程中产生了很多模糊的蛋白条带，尤其在成熟后的第12周，在小于10 kDa的蛋白下方，生成了一些小分子质量的蛋白，表明干酪C成熟过程中在GSBa-1凝乳酶的作用下，更多的蛋白位点被切断，酪蛋白被水解为小肽和氨基酸，使得干酪C和其他两组干酪蛋白条带有显著差别。

图4 切达干酪成熟过程中的SDS-PAG图谱Fig. 4 SDS-PAGE patterns of Cheddar cheeses during ripening

2.3.2 pH 4.6可溶性氮及12% TCA可溶性氮的变化

切达干酪成熟过程中pH 4.6可溶性氮（图5A）及12% TCA可溶性氮（图5B）的变化，分别以占总氮质量百分比表示。pH 4.6可溶性氮可作为蛋白质水解程度的指标，3 组干酪中的pH 4.6可溶性氮在成熟过程中均显著增加后趋于平缓，干酪A、干酪B和干酪C在第12周的pH 4.6可溶性氮质量分数分别为9.32%、11.28%和13.32%。该结果表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶对切达干酪的蛋白水解程度显著高于商业凝乳酶。与本研究结果相似，An Zhigang等[8]报道，使用解淀粉芽孢杆菌凝乳酶生产的切达干酪的pH 4.6可溶性氮含量比使用小牛凝乳酶生产的干酪高。Soodam等[27]的研究表明，随着Rhizomucor mieheii凝乳酶浓度的增加，脱脂切达干酪中的pH 4.6可溶性氮含量也显著增加。12% TCA可溶性氮代表小分子肽（2～20 个残基）和游离氨基酸的含量，主要由发酵剂和非发酵剂乳酸菌蛋白酶和肽酶产生[28]。3 组干酪中12% TCA可溶性氮在12 周成熟过程中均呈上升趋势，干酪A由1.91%上升至4.06%，干酪B由2.66%上升至4.95%，干酪C由3.22%上升至8.31%，且在整个成熟过程中存在显著差异（P＜0.05）。该结果表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶的对干酪的蛋白水解作用增强了乳酸菌的代谢活动，使乳酸菌蛋白酶和肽酶活性增加，进而产生更多的小分子肽和游离氨基酸。

图5 切达干酪成熟过程中p 4.6可溶性氮（A）和12%TCA可溶性氮（B）含量变化Fig. 5 Changes in pH 4.6 soluble nitrogen (A) and 12% TCA (B)soluble nitrogen contents of Cheddar cheeses during ripening

2.4 切达干酪成熟过程中生物活性的变化

图6 切达干酪成熟过程中钙离子螯合能力（A）和锌离子螯合能力（B）变化Fig. 6 Changes in calcium ion-clelating ability (A) and zinc ion-chelating ability (B) of Cheddar cheeses during ripening

如图6所示，干酪成熟过程中金属离子螯合能力随成熟时间的延长缓慢增加，干酪C的钙离子、锌离子螯合能力在4～12 周的成熟过程中均高于干酪A和干酪B，且干酪B的螯合能力介于干酪A和干酪C之间。尤其在干酪成熟的第12周，干酪C和干酪B的钙离子螯合能力高达57.76%和53.11%，而干酪A的钙离子螯合能力仅为49.88%。相比于干酪的钙离子螯合能力，其锌离子螯合能力则较低，干酪C和干酪B的锌离子螯合能力最高为17.70%和15.19%，而干酪A的锌离子螯合能力仅为9.71%。据报道，肽的锌离子螯合能力与肽氨基酸残基种类相关，组氨酸残基越多，肽的锌离子螯合率越大[29]，酪蛋白磷酸肽是磷酸化的酪蛋白水解物，体外细胞模型和大鼠模型实验表明，酪蛋白磷酸肽可以提高肠道钙的吸收，增加钙在骨骼中的结合，且钙的结合性能与磷酸丝氨酸磷酸基有关，去磷酸化的肽段无法与钙结合[30]。干酪C中产生了更多的具有钙结合位点的磷酸化肽段，因此，显示出了较高的钙结合能力。

图7 切达干酪成熟过程中α-葡萄糖苷酶抑制率（A）和α-淀粉酶抑制率（B）的变化Fig. 7 Changes in α-glucosidase (A) and α-amylase (B) inhibition activity during ripening of Cheddar cheeses

抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性可降低碳水化合物水解，从而减少糖被人体肠道吸收的可能性[31]。随着干酪成熟时间的延长，α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐上升至60%以上（图7A），但3 组干酪之间在整个成熟过程中差异不明显。随着成熟时间的延长，α-淀粉酶抑制率呈下降趋势（图7B），但相比于干酪A，干酪B和干酪C的α-淀粉酶抑制率下降速率减慢，在成熟期12 周时的α-淀粉酶抑制率分别为40.64%、46.50%和46.04%，但不同组干酪间没有显著差异（P＞0.05）。据报道，上述两种酶活性的抑制作用归因于蛋白酶水解产生的生物活性肽，特别是小分子活性肽[32]。由此表明，降血糖作用可能主要与发酵剂乳酸菌水解酪蛋白产生的小分子肽有关，GSBa-1凝乳酶会不影响干酪的降血糖活性。

图8 切达干酪成熟过程中DPP自由基清除率（A）和ABTS阳离子自由基清除率（B）的变化Fig. 8 Changes in DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B)scavenging capacity of Cheddar cheeses during ripening

在成熟过程中，干酪对于DPPH自由基的清除能力（图8A）先增加再降低然后趋于平缓，说明部分抗氧化肽可在干酪成熟过程中被进一步水解。而对于ABTS阳离子自由基的清除能力（图8B）则一直上升至成熟的第12周，且干酪对于ABTS阳离子自由基的清除能力更为明显。对于两种自由基的清除率，干酪C显著高于干酪A和干酪B，尤其是在干酪成熟的第4～8周，DPPH自由基清除率最高为16.49%，ABTS阳离子自由基清除率最高为78.38%。Gupta等[33]研究了不同成熟期切达干酪抗氧化活性变化，干酪成熟第4个月时，ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除能力达到最大，表明其抗氧化活性与成熟期有关。Timón等[34]研究了不同来源凝乳酶（植物、动物、微生物）制作的硬质干酪中小分子肽的抗氧化活性和金属离子螯合能力，发现使用微生物凝乳酶制作的干酪半最大效应浓度（EC50）值最低，表明其抗氧化能力和金属离子螯合能力显著高于使用动物凝乳酶和植物凝乳酶制作的干酪，这与本实验得到的结论相似。肽的功能与其结构相关，且小于3 kDa的肽段比3～5 kDa的肽段具有更高的生物活性[35]。不同凝乳酶的使用，导致干酪成熟过程中蛋白水解的变化，释放出不同结构的肽段，因此，不同组干酪的功能性有明显差异。

3 结 论

与商业凝乳酶制作的切达干酪相比，解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶制作的切达干酪在成熟过程中的pH值和微生物含量显著较低，水分含量显著较高。由于GSBa-1凝乳酶具有相对较高的蛋白水解活力，使得其制作的切达干酪pH 4.6可溶性氮和12% TCA可溶性氮含量显著较高，在成熟过程中生成了较多的小分子肽。体外生物活性实验结果表明，GSBa-1凝乳酶可以提高切达干酪成熟过程中的钙离子、锌离子螯合能力和抗氧化能力，但对干酪降血糖作用的影响不大。因此，在满足切达干酪其他性质的同时，为了提高切达干酪的生物活性，可使用解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶替代或者部分替代商业凝乳酶制作切达干酪。