黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的体外抑制作用 *

郑丽婷，周鸿，刘奕明，2，林爱华

(1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120；2.广东省中医证候临床研究重点实验室，广东 广州 510120)

糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病，它的死亡率仅次于肿瘤和心脑血管疾病，位居第三[1]。降糖药可通过促进胰岛素分泌，促进外周组织摄取葡萄糖，抑制糖异生，增强胰岛素敏感性,抑制人体消化道对糖类的吸收等治疗和控制糖尿病及其并发症。近年来研究发现，餐后高血糖是糖尿病发病过程中最先出现的症状，能够诱发各种并发症，提高糖尿病患者的死亡率[2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂能通过抑制小肠上皮细胞绒毛膜上的α-葡萄糖苷酶的活性，延缓对葡萄糖的吸收，控制餐后血糖的升高，有助于防治2型糖尿病及其并发症[3]。近年来从药用植物中筛选天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为国内外学者关注的热点[4-6]。

黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮。现代研究表明黄柏具有降血糖、抗氧化、抗炎、降压、免疫调节等多种药理活性。黄柏碱是黄柏的特征性成分和重要活性成分之一,在降血压、抗肾炎、抑制细胞免疫反应和中枢抑制等方面具有显著效果[7-8]。黄柏碱是否具有降糖相关作用而成为黄柏降血糖活性物质尚未见报道,故本实验通过建立α-葡萄糖苷酶体外筛选模型，初步探讨黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性的影响及其作用类型；采用同源模建的方法构建来源于酿酒酵母的α-葡萄糖苷酶的三维结构，并借助分子对接的方法尝试性地阐释黄柏碱抑制α-葡萄糖苷酶的机制，以期为后续探讨黄柏碱降糖作用提供基础。

1 材料

1.1 试剂

盐酸黄柏碱对照品，纯度99.44%，批号：MUST-17112110，成都曼斯特生物科技有限公司；阿卡波糖，纯度95%，批号：S11190，上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(酿酒酵母)，批号：S10050，上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，批号：S10137，上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钾，批号：S24278，上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠，分析纯，批号：20171101-1，广州化学试剂厂；无水碳酸钠，分析纯，批号：20000601-1，广州化学试剂厂。

1.2 仪器

Infinite M1000 PRO多功能酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)；ZXDP-B2050电热恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；PL303千分之一天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS105DU十万分之一天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS3数显型旋涡混匀器(德国IKA公司)；SI4002多微孔板振荡器(广州市浩瀚有限公司)。

2 方法

2.1 溶液的配制

磷酸盐缓冲液(pH 6.8)：取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL,加0.2 mol/L氢氧化钠溶液118 mL,用纯水稀释至1 000 mL，摇匀即得。

α-葡萄糖苷酶溶液：称取适量α-葡萄糖苷酶粉末，用磷酸盐缓冲液溶解定容，配成2 U/mL的母液，用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。

PNPG溶液：精密称取188.31 mg，先加1 mL DMSO溶解，再加磷酸盐缓冲液定容至25 mL，配制成25 mmol/L的母液，用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。

黄柏碱溶液：精密称取9.99 mg，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至5 mL，配制成浓度为2 000 mg/L的母液，用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度。

阿卡波糖溶液：精密称取5.04 mg，用纯水溶解并定容至5 mL，配制成1 000 mg/L的母液，用纯水稀释至所需浓度。

碳酸钠溶液：准确称取5.30 g，加250 mL蒸馏水溶解，配制成0.2 mol/L碳酸钠溶液。

2.2 黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

以PNPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，实验分为空白组(不加黄柏碱和α-葡萄糖苷酶液)、对照组(不加黄柏碱)、黄柏碱测定组、黄柏碱空白组(不加α-葡萄糖苷酶液)、阳性对照组和阳性空白组(不加α-葡萄糖苷酶液)。反应体系参照文献[9]方法，在96微孔板中加入适量(根据反应终止时体积为200 μL计算)磷酸盐缓冲液，0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL和样品溶液20 μL(反应体系中黄柏碱终浓度分别为20、50、100、150、200 mg/L；阿卡波糖的终浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/L)，低速振荡混匀，37 ℃放置10 min，加入10 mmol/L PNPG 20 μL，低速振荡混匀，37 ℃反应20 min，再加入0.2 mol/L的碳酸钠溶液80 μL终止反应，于波长405 nm处测定吸光值。按下式计算目标化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

Ac为对照组，Ab为空白组，As为样品组，Asb为样品空白组。

2.3 黄柏碱的酶抑制作用类型

2.3.1 可逆或不可逆抑制作用 选取反应后具有明显吸光度变化的酶浓度0.125、0.25、0.5 U/mL，并选取最大酶量的饱和底物浓度10 mmol/L进行实验。实验分为实验组(1 000、2 000 mg/L黄柏碱,加入到反应体系后对应的终浓度分别为166.67、333.33 mg/L)和对照组(不加黄柏碱)，反应体系参照文献[10]的方法，于96孔板加入磷酸盐缓冲液60 μL，酶液20 μL和黄柏碱溶液20 μL，低速振荡混匀，37 ℃放置10 min，加入10 mmol/L PNPG 20 μL，低速振荡混匀，37 ℃反应20 min，于波长405 nm下读取吸光值A1，将96孔板放回恒温箱继续放置10 min，于波长405 nm下读取吸光值A2，以α-葡萄糖苷酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标作图，其中反应速率为V，由下式求出，ΔT为10 min。

2.3.2 可逆抑制作用的类型 选取0.5 U/mL酶浓度，并选取有梯度的底物浓度2.5、5、10、20 mmol/L进行实验。实验分为实验组(500、1 000 mg/L黄柏碱，加入到反应体系后对应的终浓度分别为83.33、166.67 mg/L)和对照组(不加黄柏碱)，参照“2.3.1”项下的方法进行实验，以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，反应速率的倒数1/V为纵坐标作图，分别绘制不同浓度黄柏碱的抑制作用动力学曲线，确定抑制类型，由公式(1)求出最大反应速度Vmax和米氏常数Km。其中反应速率的倒数为1/V，由公式(2)求出，ΔT为10 min。

2.4 分子对接分析

2.4.1 同源建模及合理化评估 采用同源模建的方法构建酿酒酵母α-葡萄糖苷酶的三维结构。首先从UniProt蛋白序列数据库(https://www.uniprot.org/)获得酿酒酵母α-葡萄糖苷酶MAL12(P53341)的一级序列。将MAL12氨基酸序列导入SWISS-MODEL服务器(http://swissmodel.expasy.org/)匹配获得同源性最高的蛋白序列，若其相似性高于30%，则可作为MAL12建模模板，并可进一步对其蛋白序列的三级结构进行预测。为了确保MAL12的模型质量，结合SWISS-MODEL和UCLA-DOE服务器(https://www.doe-mbi.ucla.edu/)对模型质量进行评估，主要以GMQE(可信度范围为0～1，值越大表明质量越好)[11]、QMEAN(评价区间为-4～0，越接近0，评估待测蛋白与模板蛋白的匹配度越好)[12]、Verify-3D(超过80%的残基拥有大于0.2的3D/1D值，则模型质量合格)[13]、PROCHECK(合格值为90%)[14]指标和程序检验模型质量的得分值，为分子对接所需蛋白模型的合理性提供依据。

2.4.2 分子文件准备及分子对接 利用Chemdraw Ultra 14.0绘画黄柏碱和阿卡波糖的化学结构，再利用ChemBio3D Ultra 14.0将其转变为3D形式并优化其结构。使用AutoDock Tools(ADT，v.1.5.6)对配体和新建模型进行去水、加氢、计算电荷、赋予原子类型等预处理并保存为PDBQT格式备用。以α-葡萄糖苷酶同源模型的结合位点设置配体对接空腔区域，在默认参数中，采用拉马克遗传算法进行对接计算，每个配体进行100个实验。在分子对接的结果中，对接能量最低的构象最有可能是此研究预测结合模式，并使用PYMOL(DeLano Scientific LLC公司)和Discovery Studio 4.5(DS，北京迅利创成科技有限公司)进行作图示意。酶动力学实验表明黄柏碱为反竞争性抑制剂，因此首先应将PNPG与α-葡糖苷酶同源模型进行分子对接并将两者保存为PNPG-α-葡糖苷酶复合物文件，再将黄柏碱与该复合物进行分子对接分析。

3 结果

3.1 黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

由表1可见，黄柏碱和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制都呈剂量依赖关系，随着剂量的加大，抑制率增大。当黄柏碱浓度为200 mg/L时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到64.46%。黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为126.36 mg/L，表明黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，但抑制作用弱于阿卡波糖。

表1 黄柏碱和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3.2 黄柏碱的酶抑制作用类型

3.2.1 可逆或不可逆抑制作用 由图1动力学曲线可以看出，不同浓度抑制剂的曲线交于一点，并且随着反应体系中黄柏碱浓度的增大，反应速率降低，但未影响反应的发生，表明黄柏碱对α-葡萄糖苷酶的抑制属于可逆性抑制类型。

3.3 分子对接

3.3.1 同源建模及合理化评估 将α-葡萄糖苷酶MAL12的氨基酸序列导入SWISS-MODEL服务器匹配获得了50个模板，其中MAL12与3AXH序列残基相似性高达72.51%，满足同源模建同源性的要求,可将3AXH作为模板对MAL12进行同源建模。将3AXH和MAL12的序列进行比对，同时进行同源建模，结果显示两者比对的GMQE和QMEAN分别为0.92和-0.04，提示建立的蛋白模型质量水平高。见图3。

表2 黄柏碱在α-葡萄糖苷酶抑制动力学中的动力学常数

通过Verify-3D程序检测氨基酸残基与序列中其他氨基酸的位置是否兼容来判定三维结构的合理性；模型中95.16%残基得分大于0.2，说明建模结果较为合理(图4)。结合PROCHECK程序生成的Ramachandran plot进行评估，以主链的构型中ψ和φ二面角的分布情形检测模型的质量，结果显示共有99.4%的模型残基位于最佳区域和允许区域中(图5)，提示模建结构氨基酸的二面角是非常合理的。可见以3AXH为模板构建出来的模型是可靠的,该结果与以往研究结果基本一致[15]，因此，建立的模型可用于后续的分子对接分析。

3.3.2 配体和受体的分子模拟对接 利用ADT、DS、PYMOL等软件对配体和受体进行预处理和结构构建，结果如图6。根据文献研究可知[16]，该构建的α-葡萄糖苷酶同源模型存在5个活性位点，其中位点1(红色)为竞争性位点，其余4个皆定义为反竞争性位点：位点2(绿色)、位点3(黄色)、位点4(灰色)、位点5(蓝色)。

将PNPG、阿卡波糖、黄柏碱分别与α-葡萄糖苷酶的位点1进行对接，三者与α-葡萄糖苷酶的结合能分别为-32.2、-37.3、-28.0 kJ/mol，提示PNPG与α-葡萄糖苷酶的结合强于黄柏碱，而弱于阿卡波糖，说明阿卡波糖能与底物PNPG竞争位点，而黄柏碱则难以与底物PNPG竞夺结合空间，这可能是黄柏碱作为反竞争性抑制剂的主要原因。将黄柏碱分别与α-葡萄糖苷酶-PNPG复合物的位点2～5进行分子对接，结果显示，黄柏碱与酶-底物复合物的2～5位点都有不同程度的亲和，其中与位点5的结合能最低且其最好的对接构象结合能为-31.4 kJ/mol，说明相比其他位点，黄柏碱与酶-底物复合物位点5的结合最为稳定，提示黄柏碱最有可能与位点5结合而起到反竞争抑制作用。见表3。如图7所示,黄柏碱具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,可能与其与LYS15、SER295、HIS258等氨基酸残基形成氢键，与ALA289形成疏水相互作用以及与GLU10形成π-阴离子相互作用等有关。

表3 分子对接的结合能结果(kJ·mol-1)

4 讨论

本实验通过建立酶-抑制剂模型研究黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性的影响，结果显示黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，且随着黄柏碱质量浓度的升高，其抑制作用逐渐增强。进一步的酶抑制动力学试验表明黄柏碱的抑制作用属于可逆性的反竞争性抑制类型，这与阿卡波糖的竞争性抑制作用形式不同[17]。而分子对接的实验结果也进一步验证了黄柏碱和阿卡波糖不同的抑制作用形式，阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶竞争性结合位点1的结合能最低，其次是底物PNPG，提示阿卡波糖比底物PNPG更易与位点1结合。当向α-葡萄糖苷酶-PNPG体系中加入阿卡波糖时，阿卡波糖将与PNPG竞争α-葡萄糖苷酶位点1的结合从而表现为竞争性抑制作用；而黄柏碱与位点1的结合弱于PNPG，当向α-葡萄糖苷酶-PNPG体系中加入黄柏碱时，黄柏碱无法与PNPG竞争α-葡萄糖苷酶位点1的结合，更易与反竞争性位点结合而表现为反竞争性抑制作用。

本研究结果显示，黄柏碱体外对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.126 mg/mL，表明黄柏碱对α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用。小檗碱是黄柏生物碱中的主要成分[18]，有研究[19]考察了高纯度的小檗碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果显示小檗碱的IC50为2.02 mg/mL。小檗碱具有明确的降糖作用，从IC50的结果来看，黄柏碱明显低于小檗碱，提示黄柏碱可能有较好的降糖作用，可能成为黄柏降血糖作用的相关活性物质。

由于酿酒酵母α-葡萄糖苷酶的三维晶体结构尚未被解析，故本研究采用同源模建的方法建立了酿酒酵母来源的α-葡萄糖苷酶的3D模型。经多指标的综合质量评估分析可知，建立的模型具有一定的可靠性；利用模型蛋白分析了黄柏碱与α-葡萄糖苷酶相互作用的潜在机制，结果表明黄柏碱主要可能是通过与α-葡萄糖苷酶形成氢键、疏水作用和π-阴离子相互作用而发挥抑制作用。本研究为黄柏碱的降糖作用研究提供一定的参考和依据，同时还可为以黄柏碱为基础，通过结构优化，开发更加强效的黄柏碱衍生物的研究夯实了基础。