基于网络药理学和分子对接技术研究八珍益智方治疗阿尔茨海默病的潜在作用机制

夏玲，郭盛，钱大玮，武文星，卜凡淑，朱悦，赵明，牛阳，段金廒

(1.南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；2.宁夏医科大学中医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750021)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以认知功能障碍为主的神经系统退行性疾病，约占老年痴呆症病例的80%[1]。《2019年世界老年痴呆症报告》显示，全世界约有5 000万人患有老年痴呆症，随着人口老龄化，预计到2050年老年痴呆症的发病率将增加2倍，给家庭及社会带来沉重负担[2]。AD发病机制复杂，涉及神经元损伤和凋亡、神经炎症、突触受损、乙酰胆碱等神经递质不足、β淀粉样蛋白(Aβ)和tau蛋白清除障碍并沉积等[3]。目前临床常以吡拉西坦、多奈哌齐、美金刚等药物治疗AD，可一定程度上缓解或改善AD的临床症状，但存在治疗效果不理想、副作用大等问题[4]。经过长期临床实践的中药复方，因副作用小，且具有多成分、多作用靶点的特点，成为近年来AD防治药物开发的热点。

八珍益智方由龙眼肉、莲子肉、茯苓、山药、白术、益智仁、陈皮、炙甘草8味中药组成，该方重用龙眼肉为君药，开胃健脾，补虚益智；茯苓健脾安神，利窍去湿，开心益智，导浊生津，莲子肉既能补脾养心，又可益肾固精，均为臣药；佐以山药既补脾气，又益脾阴，补肾填精，可增强龙眼肉补益心脾之力[5]。全方具有增强智力、延缓衰老的作用。研究表明，八珍益智方中主要成分具有改善学习记忆能力和保护神经作用[6-10]。但是，八珍益智方防治AD的药效物质基础与作用机制并不明确。本文以八珍益智方中活性成分为研究对象，应用网络药理学[11]的研究方法，挖掘八珍益智方的主要活性成分和靶点，建立中药-活性成分-靶点-疾病之间的关系，探究八珍益智方防治AD的物质基础和作用机制，为八珍益智方的进一步开发利用提供支撑。

1 方法

1.1 八珍益智方活性化学成分收集与整理

本研究基于TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“茯苓”“山药”“白术”“益智仁”“陈皮”“甘草”为关键词，收集八珍益智方中的化学成分，将收集到的化学成分以口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18作为活性化合物的筛选条件。对于TCMSP数据库未收录的龙眼肉和莲子肉，利用BATMAN-TCM、TCMID、中国知网(CNKI)和Pubmed数据库检索其化学成分。同时，为了尽可能全面获得八珍益智方中主要活性成分的信息，本研究还结合国内外文献挖掘和整理，增加了文献报道的八珍益智方组方药材中具有抗AD的活性成分、入血成分以及中药中含量较高的活性成分。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集化学成分结构信息以及对所有成分的名称进行整理。借助TCMSP数据库查询所有潜在活性成分的靶标蛋白，利用Perl脚本，将所有筛选得到的靶点蛋白映射到Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)，将查询得到的所有蛋白名称校正为官方名称。

1.2 疾病靶点的确定

基于GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)数据库，以“Alzheimer disease”为关键词检索与疾病相关的作用靶点，并将检索得到的疾病靶点合并去重。

1.3 中药-化合物-疾病靶点网络的构建

将筛选得到的活性成分、靶标基因、药物等信息输入Cytoscape 3.7.2软件，构建中药-化合物-疾病靶点网络，运用“Network analyzer”功能分析其拓扑学属性，导出介度值、中心度值、度值等参数。

1.4 交集靶点的筛选

利用R语言3.6.3的VennDiagram数据包对八珍益智方主要化学成分作用靶点与AD疾病靶点数据集进行Venn分析，得到共同的靶点集，初步挖掘八珍益智方治疗疾病的作用靶点。

1.5 PPI网络图构建以及核心靶点的筛选

将Venn分析得到的交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)，限定物种为Homo sapiens，设置Medium confidence>0.4，获取蛋白间的相互作用信息，构建PPI网络图。将分析结果保存为tsv文件，通过Cytoscape 3.7.2软件对其进行拓扑学分析，分析内容包括度值、介度值、中心度值，其中，将大于节点平均数对应的数值节点定义为核心靶点。

1.6 基因本体(GO)和基因组百科全书(KEGG)功能富集分析

为说明方药-疾病交集靶点在基因功能中的作用，通过DAVID 6.7数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO和KEGG功能富集分析，以P<0.05为选取标准，并利用R语言3.6.3对结果作可视化处理。

1.7 分子对接

分子对接是评价药物活性成分与药物靶点结合能力的方法。利用AutoDock Vina 1.1.2对八珍益智方中的核心化合物和度值排名前5的靶点进行分子对接试验。利用PubChem数据库下载化合物sdf结构文件，导入Chem 3D软件调整化合物空间构象，Minimize能量优化，保存为mol2格式，经AutoDockTools 1.5.6分配电荷、设置可旋转键后保存为pdbqt格式文件。从PDB(https://www.rcsb.org/)下载靶蛋白的3D晶体结构(PDB ID分别为4EKL、2ZOQ、4ZS7、5T89、1GFW，pbd格式)，利用PyMol将去除靶蛋白水分子，分离原始配体和受体，得到的靶蛋白导入AutoDockTools 1.5.6加氢、分配电荷、添加原子类型后保存为pdbqt格式文件。利用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，利用GraphPad Prism 8将化合物以及对应靶蛋白对接得到的结合能构建热图。

2 结果

2.1 活性化合物及靶点的筛选

用TCMSP数据库共收集到226个化合物作用靶点，共筛选出200个符合条件的活性化合物，其中龙眼肉8个，莲子肉11个，茯苓17个，山药19个，白术15个，益智仁24个，陈皮12个，甘草94个，删重后得到188个化合物。

2.2 疾病相关靶点及交集靶点的筛选

通过GeneCards、OMIM数据库，以“Alzheimer disease”为关键词，将搜集到的靶点合并去重，得到阿尔茨海默病的相关靶点9 135个，通过R语言3.6.3的VennDiagram数据包得到188个“方药-疾病”交集靶点。

2.3 中药-化合物-疾病靶点网络构建和核心化合物分析

通过对方药-疾病交集靶点反向推导得到作用于AD的化合物为148个，运用Cytoscape 3.7.2软件将8味中药、148个化学成分及188个方药-疾病交集靶点进行关联并构建中药-化合物-疾病靶点图(图1)。网络中共包括344个节点(8种中药节点，148种化合物节点，188种靶点节点)和1 582条边。利用Cytoscape 3.7.2软件的“Network analyze”功能，以网络中节点介度值(均值为0.006 2)、中心度值(均值为0.329)、度值(均值为9.3)等参数大于均值为条件筛选得15个关键成分，其中，槲皮素(度值为114)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(度值为26)、芒柄花素(度值为25)、美迪紫檀素(度值为22)、Shinpterocarpin(度值为22)、甘草查尔酮A(度值为22)、异鼠李素(度值为20)为甘草中的成分；山柰酚(度值为72)为甘草和益智仁的共有成分；柚皮苷(度值为45)为甘草和陈皮的共有成分；豆甾醇(度值为33)为益智仁、山药、茯苓、莲子的共有成分；川陈皮素(度值为18)为陈皮中的成分；荷叶碱(度值为13)、原荷叶碱(度值为13)为莲子肉中的成分；表儿茶素(度值为12)为龙眼肉中的成分，β-谷甾醇(度值为16)为龙眼肉、山药、益智仁、陈皮和甘草共有成分。详见表1。

2.4 PPI网络的构建及核心靶点的筛选

将188个交集靶点上传至String数据库即可得到PPI图，将组织(Organism)设置为“Homo sapiens”。文件以tsv格式保存，将188个交集靶点相互作用信息上传至Cytoscape 3.7.2软件，以网络中节点介度值(均值为0.005 2)、中心度值(均值为0.522)、度值(均值为37.74)等参数大于均值为条件筛选得核心靶点37个(见图2～3)，这可能是八珍益智方治疗阿尔茨海默病的关键靶点。其中AKT1、MAPK3、IL-6、VEGFA、CASP3为度值排名前5的节点。

表1 中药-化合物-疾病靶点网络关键节点

2.5 GO功能富集分析

使用DAVID数据库进行GO富集分析得到1 331个条目(P<0.05)，包含1 120个生物过程(BP)条目(图4)，81个细胞组成(CC)条目(图5)，130个分子功能(MF)条目(图6)。在生物过程中靶点主要涉及细胞增殖调节(Regulation of cell proliferation)、对有机物质的反应(Response to organic substance)、对内源性刺激的反应(Response to endogenous stimulus)等；在细胞组成中靶点主要涉及细胞分数(Cell fraction)、细胞外间隙(Extracellular space)、不溶部分(Insoluble fraction)等；在分子功能中靶点主要涉及胺结合(Amine binding)、药物结合(Drug binding)、胺受体活性(Amine receptor activity)等。

2.6 KEGG富集分析

通过使用DAVID数据库，得到65条KEGG信号通路(P<0.05)，根据基因靶点在通路富集的数目(图7)，主要涉及癌症的途径(Pathways in cancer)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、前列腺癌(Prostate cancer)、神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)等，提示上述通路与八珍益智方干预AD的发生发展密切相关。

2.7 分子对接结果

一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。参考文献以结合能≤-5.0 kJ/mol(约为-1.2 kcal/mol)作为筛选标准[12]，将“2.3”项中筛出的15个核心化合物以及“2.4”项中度值排名前5的核心靶点进行分子对接。结果显示核心化合物与AKT1、MAPK3、IL-6、VEGFA、CASP3结合能均远小于-5.0 kJ/mol，提示化合物与靶蛋白的结合活性较高。热图分析发现，与AKT1(PDB ID：4EKL)对接结合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有5个，分别是槲皮素、豆甾醇、Shinpterocarpin、异鼠李素和荷叶碱；与MAPK3(PDB ID：2ZOQ)对接结合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有7个，分别是槲皮素、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、芒柄花素、甘草查尔酮 A、Shinpterocarpin和美迪紫檀素；与IL-6(PDB ID：4ZS7)对接结合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有1个，为Shinpterocarpin；与VEGFA(PDB ID：5T89)对接结合能小于-33.472 kJ/mol的活性成分有2个，分别为Shinpterocarpin和美迪紫檀素；与CASP3(PDB ID：1GFW)对接结合能所有化合物均大于-33.472 kJ/mol。详见图8。

分子对接结果表明，通过网络药理学筛选得到的核心化合物和关键靶点都具有较好的结合活性。有研究表明，槲皮素、山柰酚、柚皮苷可以抑制AD模型动物或细胞的MAPK表达[13]，从实验角度说明了筛选结果的可靠性。

3 讨论

TCMSP是中药网络药理学研究常用数据库，但是，满足OB≥30%及DL≥0.18特征的陈皮黄酮类成分(如陈皮素)在数据库中未见收录。改善认知为益智仁的传统功效，但数据库未收录益智仁中具有神经保护作用的黄酮类、二苯庚烷类、倍半萜类成分[14]以及具有改善学习记忆的挥发油成分[15-16]。此外，白术药材中含有的白术内酯Ⅰ、白术酮、双白术内酯等虽不满足筛选条件，但已有文献报道其具有抗AD作用[17]。本文在TCMSP数据库的基础上，经文献查阅及数据挖掘，增加了8味药材中具有抗AD作用以及可以入血的成分，对TCMSP数据库的筛选结果进行了补充，为下一步的靶点预测以及通路筛选奠定基础。

从八珍益智方中药-化合物-疾病靶点网络分析中可以推测，槲皮素、山柰酚、柚皮苷等化学成分是与AD相关靶点作用最多的化学成分，提示其可能与八珍益智方治疗AD密切相关。据报道，槲皮素可以通过血脑屏障，对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用[18]，且可通过诱导神经保护[19]和预防tau蛋白病变[20]减轻AD的症状。山柰酚可剂量依赖性保护大鼠脑I/R组织梗死体积，改善神经功能损伤，抑制小胶质细胞的激活，调节细胞因子的分泌，减少炎症蛋白的表达，从而抑制神经炎症以及保护血脑屏障功能[21]。柚皮苷可通过降低海马核因子-κB(NF-κB)、Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶2(COX2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平及其免疫反应性，从而减轻脂多糖引起的认知功能障碍和神经炎症[22],推测上述物质可能是八珍益智方抗AD的潜在药效物质。

KEGG代谢通路结果显示，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路富集了24个靶点，提示该通路可能与八珍益智方治疗AD有关。MAPK是一组细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在哺乳动物中主要由细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)、氨基末端激酶(JNK)和p38蛋白激酶(p38 MAPK)三条信号转导途径组成，参与调节细胞的生长、发育、分化、凋亡等，与学习记忆能力有密切联系。MAPK通路与AD的病理机制密切相关，可以抑制Aβ诱导的神经元损伤、改善靶向Tau病理学、减轻神经炎症和提高突触可塑性等[23]。文献报道白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ可以通过MAPK信号通路发挥抗炎作用，从炎症通路发挥抗AD的作用[24]。上述研究结果在一定程度上为本研究提供了实验依据，为开展相关验证研究奠定了理论基础。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法分析了八珍益智方防治AD的潜在化学组分及调控分子机制，通过筛选得到148个潜在活性成分和188个潜在作用靶点，有65条代谢通路可能与AD有关，涉及MAPK信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路等，揭示八珍益智方可通过减轻炎症反应、增强胆碱能功能、调节tau蛋白、调控钙平衡等多种途径来发挥治疗AD的效果，表现出多成分、多靶点、多通路的作用特点。本文通过结合文献研究、网络分析、分子对接，对八珍益智方的化学成分、作用靶点和相关疾病信号通路进行了探索性研究，为八珍益智方抗AD的后续实验研究提供一定的理论基础。