好忘方改善AD模型小鼠认知障碍及机制研究 *

郭小燕，张海楼，夏宝妹，陶伟伟，李文佳，徐联调，沈琴琴，邹之璐，陈刚

(南京中医药大学转化系统生物学与神经科学研究中心，中医脑病研究重点实验室，江苏 南京 210023)

阿尔茨海默病(AD)是一种以淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结和认知功能损害为主要特征的神经退行性脑疾病[1]。其一线治疗药物主要是以多奈哌齐为代表的乙酰胆碱酯酶抑制剂及美金刚为代表的NMDA受体拮抗剂[2]。然而，由于这些药物靶点单一、疗效低且具有头晕、头痛、嗜睡、肝毒性、胃肠功能障碍等副作用，寻找更安全、快速、有效的药物成为AD治疗的迫切需求[3-4]。

鉴于Aβ斑块在AD病理学中的重要作用，β-淀粉样蛋白(或Aβ级联)假说多年来一直主导AD研究领域[5]。然而，大量的Aβ靶向治疗在临床试验中失败，使AD研究转向了磷酸化TAU的清除和突触可塑性增强等新靶点[6]。此外，以多靶点为特征的中医药受到越来越多的关注[7]。中医药治疗痴呆具有悠久的历史，现代研究表明其对治疗老年痴呆症患者具有明显的疗效和安全性，是AD治疗的重大潜力[8-10]。

从中医角度，AD为本虚标实的疾病，而多见肾虚髓亏为本、痰蒙脑窍为标。补肾益精填髓、豁痰开窍是中医治疗AD的重要治法。好忘方出自于唐代著名医家孙思邈《备急千金要方》，由续断、肉苁蓉、远志、茯苓、菖蒲组成，是益精填髓与豁痰开窍并用的治疗健忘的经典方剂，但其应用于AD的治疗研究还相对缺乏[11]。

TAU蛋白病变和突触可塑性的异常是AD的重要特征，二者皆可导致认知损害[12-13]。有研究报道，补肾化痰方药可通过失活AD模型大鼠的GSK3β，从而降低磷酸化TAU的蛋白水平[14]。此外，一些独立研究发现过度磷酸化的TAU与突触可塑性损伤密切相关，其可能是AD和其他TAU蛋白病的突触损伤的实施者[15]。cAMP依赖性蛋白激酶PKA，对神经元分化、存活、活动、可塑性及学习和记忆具有重要作用[16]。PKA可激活GSK3β-Ser9，减少TAU的过度磷酸化，也可磷酸化CREB，提高脑源性神经营养因子BDNF及突触蛋白SYNAPSIN1、GLUR1、PSD95的蛋白水平[17-19]。BDNF在神经元神经递质释放、树突重塑和轴突生长过程中起着至关重要的作用，是促进突触可塑性的重要分子[20-21]。

本研究探索了好忘方对AD小鼠模型：东莨菪碱模型和SAMP8模型的认知改善作用及其与PKA介导的磷酸化TAU的清除和突触可塑性的增强作用的联系。

1 材料

1.1 实验动物

20～25 g雄性ICR小鼠及C57BL/6J小鼠由常州卡文斯实验动物有限公司提供,动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。雄性SAMP8小鼠由北京大学提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0010。饲养于南京中医药大学转化系统生物学与神经科学研究中心SPF级动物屏障房内。东莨菪碱实验中，小鼠饲养1周后开始实验；SAMP8实验中，小鼠饲养至5月龄开始实验。动物房室温22～24 ℃，明暗交替时间为12 h，动物可自由饮食进水。所有动物实验均符合南京中医药大学动物管理与使用委员会批准的实验动物管理和使用指南。

1.2 药物

实验药物购于南京中医药大学国医堂门诊部。好忘方主要药物组成为续断、肉苁蓉、茯苓、远志、菖蒲，按8∶8∶3∶3∶3用量。将上述5种药材粉碎，过100目筛，混合后浸泡于95%乙醇中(6倍体积)24 h，期间不停搅拌，静置后取上清。该过程重复2次。将收集到的上清液过滤并减压浓缩至无乙醇。灌胃给药时，使用0.9%生理盐水配成0.41 mg/mL浓度。盐酸多奈哌齐片由江苏豪森药业股份有限公司生产，使用0.9%生理盐水配成0.5 mg/mL(东莨菪碱实验)和0.3 mg/mL(SAMP8实验)备用。氢溴酸东莨菪碱由南京良纬公司提供，使用0.9%生理盐水配成0.1 mg/mL备用。

2 方法

2.1 实验分组与给药

东莨菪碱实验：将雄性ICR小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、好忘方组、多奈哌齐组。各组给予7 d的灌胃给药治疗，空白对照组和模型对照组给予0.9%的生理盐水。在3～7 d，小鼠灌胃给药1 h后腹腔注射1 mg/kg的东莨菪碱造模，空白对照组腹腔注射生理盐水。灌胃给药剂量：好忘方组4.1 g/kg，多奈哌齐组5 mg/kg。

SAMP8实验：将5月龄雄性SAMP8小鼠分为模型对照组、好忘方组、多奈哌齐组，并选用同年龄大小的雄性C57BL/6J小鼠作为空白对照。小鼠连续灌胃给药3周。给药剂量：好忘方4.1 g/kg，多奈哌齐3 mg/kg。

2.2 行为测试

2.2.1 Morris水迷宫(MWM) 迷宫是一个注有水(24±1)℃的圆形水池(直径150 cm，高50 cm)。迷宫分为4个象限，在其中一个象限水下1 cm处放置直径10 cm的站台。小鼠连续训练4 d，每天训练2个象限。训练时，将小鼠面朝壁放入水中，若小鼠在60 s内找到站台,则让其在站台待10 s。若不能找到站台，则将其引至站台，并让其站台待10 s。第5天，先进行定位导航测试：将小鼠面朝壁从站台邻近象限放入水中60 s，记录小鼠从入水至上站台的潜伏期。3 h后进行空间探索测试：撤除平台，将小鼠从离站台最远象限面朝外壁放入池中,记录60 s内小鼠在站台所在象限游泳的路程百分比和穿越平台位置的次数。

2.2.2 新物体识别(NOR) 在46 cm×30 cm×16 cm的开场两端的中间放置两个形状、颜色、材质相同的物体。将小鼠放置于开场中熟悉物体10 min。6 h后，将开场中的一个物体替换为形状、颜色、材质不同的新物体，然后将小鼠置于开场中5 min，记录小鼠探索新旧物体的次数。检测指标：新物体识别指数=探索新物体的次数/探索新旧物体的总次数。

2.3 Western blot实验

小鼠行为学测试结束后，立即进行冰上取脑，分离海马组织。将海马组织称质量并置于裂解液中匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，用Nanodrop(Thermo)测定样品蛋白浓度。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，取2 μL样品/泳道上样，根据蛋白分子量选择分离胶(10%或15%)分离蛋白质，然后转至PVDF膜上。转膜结束后，3%BSA室温封闭膜1 h，随后分别加入PKA(Cell Signaling Technology，1∶3 000)，GSK3β-Ser9(Cell Signaling Technology，1∶20 000)，GSK3β(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TAU-Ser404(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TAU(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，p-CREB(Cell Signaling Technology，1∶500)，CREB(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，BDNF(Santa Cruz Biotechnology，1∶200)，SYNAPSIN1(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，GLUR1(Cell Signaling Technology，1∶1 000)，PSD95(Cell Signaling Technology，1∶2 000)，TUBLIN(Cell Signaling Technology，1∶5 000)，GAPDH(Cell Signaling Technology，1∶5 000)。4 ℃孵育过夜。次日TBST漂洗10 min×3次后，二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。TBST漂洗10 min×3次，加入ECL发光底物显色。全自动化学发光图像分析系统显影分析(Tanon 5200)。用目的蛋白与各自TUBLIN或GAPDH蛋白灰度比值表示其相对蛋白量。实验重复3次。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 好忘方改善东莨菪碱模型小鼠认知障碍

经东莨菪碱造模后，MWM测试中，模型小鼠与空白对照组相比，逃避潜伏期明显上升，站台穿越次数显著下降。好忘方和多奈哌齐治疗皆可显著提升小鼠站台穿越次数(P<0.01)。给药1周后，逃避潜伏期方面，模型对照组和多奈哌齐组与空白对照组相比，仍具显著差异。好忘方组与空白对照组相比，无统计学差异(P>0.05)。见图1。

3.2 好忘方改善SAMP8小鼠认知障碍

5月龄雄性SAMP8小鼠与同龄对照雄性C57BL/6J小鼠每天分别给予好忘方和多奈哌齐治疗，连续给药3周。第17～20天给药结束1 h后，进行MWM训练。第21天进行MWM测试，第22天进行NOR测试。MWM测试中，与空白对照组相比，模型对照组逃避潜伏期明显增长(P<0.01，图2a)，站台穿越次数(P<0.01，图2b)和目标象限路程比(P<0.05，图2c)显著降低。NOR测试中，与空白对照组相比，模型对照组新物体识别指数明显下降(P<0.01，图2d)。好忘方和多奈哌齐给药治疗均可显著缩短小鼠MWM逃避潜伏期(P<0.01)，提升NOR指数(P<0.05)。此外，好忘方可提高MWM目标象限比，且在缩短逃避潜伏期方面，优于多奈哌齐(P<0.05)。

3.3 好忘方逆转SAMP8模型小鼠海马区PKA-GSK3β-TAU通路表达

与空白对照组相比，模型对照组海马中PKA(P<0.01，图3a)、GSK3β-Ser9(P<0.01，图3b)蛋白水平显著降低，TAU-Ser404(P<0.01，图3c)水平明显上升。好忘方与多奈哌齐治疗显著提高了SAMP8小鼠GSK3β-Ser9(P<0.05)蛋白水平，降低了TAU-Ser404(P<0.01)蛋白水平。此外，治疗后，好忘方组GSK3β-Ser9水平明显高于多奈哌齐组(P<0.01)。

3.4 好忘方逆转SAMP8模型小鼠海马区PKA-CREB通路表达

与空白对照组相比，模型对照组海马p-CREB(P<0.05，图4a)及其下游BDNF(P<0.01，图4b)和突触蛋白SYNAPSIN1(P<0.01，图4c)、GLUR1(P<0.01，图4d)、PSD95(P<0.01，图4e)蛋白水平均显著下降。好忘方和多奈哌齐治疗均能显著逆转以上蛋白的下调(P<0.01)。

4 讨论

AD是常见的神经退行性疾病，占痴呆总数的50%～70%。根据AD世界报告，2015年全球有4 680万AD患者，预计到2050年将增加到1.315亿[22]。目前我国AD患者已达到600万，且随着人口老龄化的加剧，发病率将呈逐渐上升趋势，给社会和家庭带来巨大的影响[23]。由于AD主流治疗药物不能延缓疾病进程，且伴有肝毒性等不良反应，寻求切实有效的治疗方法，具有重要的意义[24]。

本研究发现，中医经典方剂好忘方可显著提升东莨菪碱模型小鼠MWM站台穿越次数，逆转SAMP8模型小鼠在MWM中逃避潜伏期的延长，站台穿越次数和目标象限路程比的减少及NOR指数的下降，上调SAMP8小鼠PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路的蛋白水平。

本实验使用了两种AD动物模型：东莨菪碱小鼠模型和SAMP8小鼠模型。东莨菪碱是一种毒蕈碱性乙酰胆碱受体阻滞剂，可诱导中枢神经系统中胆碱能信号的失调，导致认知缺陷[25]。研究发现，AD患者的大脑表现出胆碱能神经系统的明显损伤，乙酰胆碱酯酶活性增加[26]。因此东莨菪碱诱导的健忘症模型被广泛用于探索记忆功能障碍。SAMP8小鼠因其呈现出皮质萎缩，神经元细胞丢失，神经胶质增生，氧化应激，Aβ蛋白水平升高，TAU过度磷酸化，学习和记忆缺陷等与AD相似的病理症状，是研究AD较为理想的动物模型[27-28]。Morris水迷宫是基于啮齿类动物对水中游泳的厌恶而产生逃生本能，并要求动物依据视觉空间线索，找到水下平台位置的测试，是经典的评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的检测方法[29]。新物体识别测试是检测小鼠视觉记忆的重要测试。本研究中，东莨菪碱模型小鼠出现MWM逃避潜伏期延长和站台穿越次数减少，提示模型小鼠已出现认知损害，而给予好忘方治疗后，造模小鼠站台穿越次数显著上升，说明好忘方具有改善空间记忆功能的效果。SAMP8模型中，模型小鼠在Morris水迷宫和新物体识别测试中均呈现认知损害，说明小鼠空间记忆能力和视觉认知皆受损，这与研究报道的5月龄SAMP8小鼠已经呈现出AD方面的认知损害较为一致[30]。研究发现，好忘方给药后逆转了SAMP8小鼠在Morris水迷宫和NOR识别方面的认知损害，揭示出好忘方具有改善AD模型小鼠空间记忆和视觉记忆的作用。此外，好忘方组在缩短MWM逃避潜伏期方面明显优于多奈哌齐组，这说明好忘方在改善小鼠空间记忆障碍方面可能优于多奈哌齐。目前AD药物研究中，在逆转AD小鼠模型认知损害方面具有与多奈哌齐相似疗效的药物较为常见，但治疗效果明显优于多奈哌齐的药物较为少见[31-34]。

磷酸化TAU蛋白是AD最突出的病理标志物之一神经纤维缠结(NFT)的主要成分。TAU-Ser404是NFT主要纤维成分成对螺旋长丝中的主要位点[35]。异常TAU蛋白不仅失去其正常的生理功能，其沉积更会产生新的毒性，且引起AD患者的认知功能下降[36-38]。突触可塑性是指脑内学习记忆的编码和储存时突触在数量、结构以及功能上发生的有序变化[39]。过磷酸化TAU和突触可塑性损害是AD重要的病理特征。研究发现，过磷酸化TAU可能是造成AD突触可塑性损害的重要原因。好忘方给药后，逆转了PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路的蛋白水平。已有研究报道，补肾化痰方对GSK3β-TAU通路具有调节作用，但关于其同时改善AD模型动物PKA-GSK3β-TAU和PKA-CREB通路报道尚为罕见。

综上所述，本研究发现中医经典补肾化痰方剂好忘方可以有效改善AD模型小鼠的认知障碍，而这种改善作用与PKA介导的磷酸化TAU的清除及突触可塑性的增强作用有关。