氮掺杂碳纳米酶联合近红外光抗真菌体外试验研究

余 凡 苏 欣 安兰芳 周丝雨 高利增 朱晓芳

1大连医科大学，辽宁大连，116044；2扬州大学医学院，江苏扬州，225001；3中南大学湘雅二医院，湖南长沙，410011；4中国科学院生物物理研究所中国科学院纳米酶工程实验室，北京，100101；5扬州大学临床医学院皮肤科，江苏扬州，225001

纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料[1]，广泛应用于生物医学领域，在抗肿瘤和抗菌方面取得了一定的成果[2-7]。纳米酶可以通过不同的操作(包括磁场、光、超声和热)来进行远程控制[8]，其酶活性也可以通过外部物理或生物刺激(例如光或pH)来调节[9]。氮掺杂碳纳米酶(nitrogen-doped carbon nanozyme, N-Carbon nanozyme)是一种新兴的纳米酶，具有四种酶样活性：氧化酶，过氧化物酶，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，能够催化活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的产生和清除[10]。

最近，利用光吸收剂吸收光能并释放热能的光热疗法(photothermal therapy, PTT)已经广泛应用于多个领域。PTT具有许多优点，例如微创性、不良反应少以及时空选择性的优点[11]。基于各种碳材料(如碳纳米管和石墨烯材料)的PTT已被研究用于癌症治疗、药物输送和抗菌治疗[12]。

N-Carbon nanozyme不仅具有酶催化活性，还具有光热效应，而近红外光(near infrared, NIR)具有显著的热效应。因此，在本论文中我们以白念珠菌和红色毛癣菌为研究对象，进行了N-Carbon nanozyme联合808 nmNIR体外抗真菌实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准菌株 红色毛癣菌(ATCC MYA 4438)购自中国医学科学院皮肤病研究所；白念珠菌(ATCC 10231)购自中国科学院微生物研究所。

1.1.2 主要试剂 戊二醛，福尔马林水溶液(37wt%)，苯酚和三聚氰胺购自国药集团化学试剂有限公司，三嵌段共聚物Pluronic F127(MW=12600，PEO106PPO70-PEO106)购自Acros Organics(美国)，PI荧光染料购自Invitrogen(美国)，SYTO 9绿色荧光核酸染料购自Life Technologies Corporation。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)按照标准制备。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 所有实验用菌株接种在PDA斜面培养基上，活化2次(白念珠菌在37℃培养2 d，红色毛癣菌在28℃培养7～14 d)。

1.2.2 菌悬液的制备 红色毛癣菌：取活化好的红色毛癣菌标准菌株，加入无菌生理盐水1 mL，用刮勺轻轻搔刮真菌菌落，将所得混悬液静置15 min沉淀菌丝，取上清液，采用分光光度计在600 nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于(1～5)×106CFU/mL，备用。

白念珠菌：挑取白念珠菌菌落，接种于5 mL SDB培养液中，于37℃震荡培养，活化2次，培养24 h使真菌处于对数生长期。采用分光光度计在600 nm处，调整菌悬液至0.7个麦氏单位浊度，相当于(1～5)×107CFU/mL，备用。

1.2.3 N-Carbon nanozyme的制备和表征 我们分别以含有三聚氰胺和福尔马林/苯酚的F127软模板为氮和碳源，根据文献报道[13-15]，采用热解法制备N-Carbon nanozyme。N-Carbon nanozyme的表征采用场发射扫描电镜(S-4800II，Hitachi，日本)和透射电镜(Tecnai 12，Philips，荷兰)进行观察。

1.2.4 N-Carbon nanozyme浓度及NIR照射能量的筛选 取白念珠菌菌悬液，分别固定N-Carbon nanozyme浓度、NIR照射功率及时长中的2个变量进行试验，总计反应30 min，稀释后取100 μL均匀涂布于SDA培养基平板上，每组重复2次，于37℃培养箱培养36 h后数菌。最后选择N-Carbon nanozyme的浓度为250 μg/mL，NIR的功率为2.5 W/cm2，照光时长为8 min。

1.2.5 体外抗真菌试验分组 取培养好的真菌随机分为四组：(1)空白对照组：仅真菌，不进行任何处理；(2)光照组：用功率为2.5 W/cm2的NIR照射真菌8 min；(3)材料组：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme处理30 min；(4)实验组：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme，同时进行NIR照射8 min。

1.2.6 体外抗真菌效果判断 本研究中抗真菌活性观察采用共聚焦荧光染色，因有活性和无活性真菌的细胞膜通透性存在差异，使用SYTO 9/PI染色可以判断菌体活性的变化。SYTO 9核酸染色剂是一种绿色荧光染料，可以对活细胞和死细胞进行染色以定位真菌[16]。PI是一种红色荧光染料，仅能穿透受损细胞膜对核酸进行染色，因此可标记死细胞[17]。对白念珠菌抗菌活性研究还采用了扫描电镜观察形态以及平板计数法，根据菌落形成单位(CFU)的数量来判定(该实验重复3遍)。

共聚焦荧光测定：24孔板中，放入无菌玻片，白念珠菌、红色毛癣菌各分为4组，每组设3个复孔，白念珠菌在SDB中培养36 h，红色毛癣菌在SDB中培养7 d，经各组实验处理结束后，用PI染色20 min，然后SYTO 9复染10 min后，用共聚焦荧光显微镜(TCS SP8 STED，Leica，德国)来观察。该实验重复3遍。

扫描电镜观察：白念珠菌培养同上，经各组实验作用结束后，用2.5%戊二醛固定。然后，将细胞通过一系列乙醇/水混合物进行梯度脱水，并通过CO2超临界干燥。最后，使用场发射扫描电镜(GeminiSEM 300，Zeiss，英国)观察所获得的干燥真菌。该实验重复3遍。

1.2.7 统计学方法 本研究部分数据结果采用SPSS 19进行单因素方差分析，两两之间比较采用LSD-t方法，检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 N-Carbon nanozyme的表征 通过透射电镜、扫描电镜观察，碳纳米球表现出基本统一的大小，直径约为(150±10)nm，并且表面表现出多孔结构的特点(图1)。

1a：扫描电镜图像；1b：透射电镜图像

2.2 N-Carbon nanozyme的光热效应观察 N-Carbon nanozyme经NIR照射后，可以将近红外光转换为热能。随着N-Carbon nanozyme浓度的增加温度升高更明显，可见光热转换效率具有浓度依赖性(图2a)。N-Carbon nanozyme浓度固定的情况下，NIR的功率越高温度升高越明显，可见光热转换效率也与功率的强度有关(图2b)。

2a：在NIR(2.5 W/cm2)照射下，不同浓度的N-Carbon nanozyme的温度升高情况；2b：250 μg/mL的N-Carbon nanozyme在NIR不同能量密度照射下的温度升高情况

2.3 N-Carbon nanozyme联合NIR对白念珠菌的抑菌作用 根据平板计数法来直观地观察N-Carbon nanozyme及NIR对白念珠菌的抑菌效果。结果如图3a、4a，与空白对照组相比，光照组和材料组中白念珠菌的存活率仍高，未见明显死亡。而实验组中白念珠菌的活力明显降低，抑菌率为99.9%以上，降低了至少3-log10(P<0.0001)。而且，N-Carbon nanozyme联合NIR的抗菌能力，与N-Carbon nanozyme的浓度(图4c)和NIR照射的能量密度有关(图4d)。同时，为了进一步了解加热对白念珠菌的影响，我们进行了对比测试。因N-Carbon nanozyme经NIR照射8 min诱导的温度约为50℃，所以设置50℃水浴对照组。结果如图3b、4b，与空白对照组相比，温度对照组和实验组中白念珠菌的活力均明显降低(P<0.001)。虽然水浴的外部加热确实会诱导白念珠菌的死亡，但抗菌效果不如实验组(P<0.0001)。

为进一步验证N-Carbon nanozyme的光热抗菌作用，将经各组实验处理后的白念珠菌样品使用SYTO 9/PI进行染色，通过共聚焦显微镜收集荧光图像。如图5，空白对照组几乎没有红色荧光，而光照组和材料组可见少量红色荧光，说明很大比例的白念珠菌仍然存活。相反，在实验组的图像中能观察到明显的红色荧光，这意味着几乎所有的真菌都被光热处理杀灭。因此，所有结果表明，借助于808 nm的近红外光照射，N-Carbon nanozyme具有高效的抗真菌能力。

同时，我们运用扫描电镜观察经各组实验处理后的白念珠菌的形态变化，进一步探讨N-Carbon nanozyme联合NIR对白念珠菌的影响。如图6，对照组中的白念珠菌表现出典型的球状形状，细胞壁完整且光滑；光照组和材料组中白念珠菌没有显示出可观察到的壁损伤或细胞死亡。但是，实验组中可观察到，尽管某些真菌细胞仍保持其完整性，但细胞形态发生明显的改变，变得粗糙及皱缩。

2.4 N-Carbon nanozyme联合NIR对红色毛癣菌的抑菌效果 我们运用SYTO 9/PI死活染色法对处理后的的红色毛癣菌样品进行染色。结果如图7，空白对照组、光照组及材料组均存在部分红色荧光，但仍有很大比例的红色毛癣菌存活。相反，在实验组中，观察到较大比例的红色荧光，这意味着大部分的红色毛癣菌被光热处理杀灭。

3a：光照组、材料组与空白对照组间菌落数未见明显差异，而实验组可见菌落明显减少;3b：与空白对照组相比，实验组、温度对照组(50℃水浴8 min)的菌落数均见明显减少，而实验组与温度对照组相比，减少更明显

4a：白念珠菌在经NIR或(和)N-Carbon nanozyme处理后的菌体活力；4b：白念珠菌在50℃水浴(8 min)与经N-Carbon nanozyme+NIR处理后的菌体活力；4c：在NIR(2.5 W/cm2，8 min)照射下，白念珠菌经不同浓度的N-Carbon nanozyme处理后的菌体活力；4d：白念珠菌经NIR(8 min)不同能量密度及N-Carbon nanozyme(250 μg/mL)处理后的菌体活力 注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001，“****”表示P<0.0001

绿色定位所有白念珠菌，红色代表死亡白念珠菌；其中空白对照组几乎没有红色荧光，而光照组和材料组可见少量红色荧光，试验组见大量红色荧光

3 讨论

皮肤浅部真菌感染主要侵犯皮肤、黏膜、毛发和甲，病原体主要以皮肤癣菌为主，其次是念珠菌，且现在念珠菌感染有逐渐上升趋势[18,19]。现因多种因素导致浅部真菌感染的发生越来越多，虽然危害小，但也严重影响患者的生活质量[20]。同时因为患者不规范用药，诱导耐药菌株的产生，也为临床诊断和治疗增加了困难。而开发高效、低毒、广谱且廉价的抗真菌药物是全球关注的热点。

6a:对照组中的白念珠菌表现出典型的球状形状，细胞壁完整且光滑；6b、6c:光照组和材料组的白念珠菌未见明显改变；6d:实验组白念珠菌细胞表面变得粗糙及皱缩

N-Carbon nanozyme作为新兴的纳米酶，可以调节ROS的产生和清除，杂原子氮掺杂和石墨结构都是实现上述类酶活性的必要条件，而其结构的多孔性提高了它们的活性。因为多孔界面提供了大量的活性位点，有利于催化过程中的质量运输[10]。同时碳纳米材料能吸收某种波段的光尤其是NIR的能量，通过等离子体共振或者能量跃迁带，将吸收的光转化为热能，从而导致局部高温[21]。

本研究表明，N-Carbon nanozyme联合近红外光对白念珠菌及红色毛癣菌均有明显的抗菌作用，通过吸收光能迅速转换为热能，导致真菌细胞壁及细胞膜的破坏。但因为水浴加热的抑菌效果明显不如N-Carbon nanozyme联合NIR的抑菌效果，因此，我们需要深入分析NIR照射N-Carbon nanozyme后产生的热量对真菌活力的影响。首先，使用水浴的加热方式是外部的；NIR照射时的加热是内部的，浓缩在N-Carbon nanozyme的表面上。而且，在某些时候，N-Carbon nanozyme的表面温度可能高于本体溶液中的温度。此外，N-Carbon nanozyme还可能黏附在真菌壁上，这种相对较高的表面温度有利于破坏细胞壁，最终杀死真菌。其次，这两条加热路线之间的差异也提醒我们，加热可能不是光热抗菌疗法的唯一因素。考虑到N-Carbon nanozyme在一定条件下表现出多种酶样活性，推测其抗真菌的机制除热损伤外还包括：(1)高水平ROS破坏真菌膜，导致细胞内基质渗漏，致使真菌细胞失活。同时，DNA也受影响而裂解；(2)可能破坏真菌体内的氧化还原平衡，导致真菌快速死亡[22]。不过具体作用机制还需要进一步的研究来验证。N-Carbon nanozyme经NIR照射8 min诱导的温度约为50℃，而人体皮肤的最高耐受温度约为46℃，因此我们后续需要在材料上或光照参数上进一步优化，以期实现在机体耐受温度范围内达到最佳抗真菌效果。本研究中关于N-Carbon nanozyme抗红色毛癣菌无直观的抑菌效果分析，主要限于红色毛癣菌的形态特异性、材料的颗粒性和有色性以及808 nm激光器照光条件(光斑直径约5 mm)，无法使用常规的抗真菌药敏试验M38-A2方案及平板计数法等多种方法，需要探索其他切实可行的方法来验证N-Carbon nanozyme联合NIR抗皮肤癣菌的效果。

绿色定位所有红色毛癣菌，红色代表死亡红色毛癣菌；其中空白对照组、光照组和材料组可见少量红色荧光，试验组见大量红色荧光

我们的研究结果初步表明N-Carbon nanozyme联合NIR对白念珠菌及红色毛癣菌均有明显的抑制效果，但如何选择材料的浓度及NIR的能量密度、时长等是关键，需要做到对真菌造成最大损伤的同时尽可能减小对人体的伤害。目前已有研究报道在铁蛋白的引导下，N-Carbon nanozyme在人类肿瘤异种移植小鼠模型的体内试验中能靶向肿瘤细胞，产生活性氧，从而有效抑制肿瘤细胞，重要的是，N-Carbon nanozyme在生理条件下会降解[10]。那么我们也可以试想，是否也可以运用某种靶向因子，特定作用于真菌细胞，减少对宿主的伤害，而皮肤浅表真菌感染位于体表，应用相对容易实现，也比较安全。因此，N-Carbon nanozyme联合NIR抗真菌是一个研究方向，具有潜在的应用前景。