大黄素对黑素瘤B16F10细胞增殖、迁移及凋亡的影响

袁铭杰 刘天一 陈 亮 王万晨 刘 驰 毕 波

复旦大学附属华东医院整形美容外科，上海，200040

恶性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一种来源于黑素细胞的肿瘤，其恶性程度高，预后差。目前MM的发病率约以每年3%～5%的速度增长，近年来，其死亡率也存在逐渐升高的趋势[1]。目前国内针对晚期恶性黑素瘤患者，临床常用的治疗手段仍以姑息手术、化疗和放疗为主，但治疗效果并不理想[2]。因此，有待发现新的黑素瘤治疗方法。大黄素(emodin)是一种提取自大黄、虎杖、何首乌等多种中药材根茎中的天然蒽醌类衍生物，许多研究表明，大黄素具有抗炎、抑菌及免疫调节等多种生物学作用[3-5]。且随着对大黄素抗肿瘤活性研究的进一步深入，研究人员发现大黄素可通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移，并促进其凋亡等方式对肺癌，乳腺癌等肿瘤起抑制作用[6,7]。本研究主要观察大黄素对小鼠黑素瘤细胞B16F10增殖，迁移及凋亡情况的影响，为大黄素治疗黑素瘤的临床应用上提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂 小鼠黑素瘤B16F10细胞，购自中国科学院细胞库；大黄素、二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司；DMEM培养基，胎牛血清，CCK-8试剂盒，0.25% EDTA-胰酶购自美国Gibco公司；TUNEL试剂盒，PI染液，DAPI染色试剂盒购自南京凯基生物有限公司；青霉素、链霉素溶液购自Amresco公司；6孔细胞培养皿和96 孔细胞培养皿购自美国Costar公司。caspase-3抗体购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 药物配制 大黄素用DMSO溶解成0.2 mmol/L母液，放置-20℃冰箱保存，使用时用DEME培养基稀释成所需浓度，DMSO在大黄素溶液中的质量分数小于0.1%。

1.2.2 细胞培养 取生长状态良好B16F10细胞，用加入10%的胎牛血清，青霉素(终浓度100 U/L)及链霉素(终浓度100 mg/L)的DMEM培养液(pH=7.4)，在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3 细胞增殖实验 取对数生长期的细胞，PBS清洗两遍，加入0.25%的胰酶室温消化细胞并转移至离心管中，重悬细胞后，采用血细胞计数板于显微镜下进行细胞计数，取1×104/孔密度接种于96孔板中，对照组加入0.1% DMSO溶液，实验组加入10、20、40、60、80 μmol/L大黄素处理24 h及48 h，加入10 μL CCK-8试剂，培养箱内孵育4 h后，酶标仪450 nm下检测吸光值，同时设置空白调零组(不加细胞只加入等量的 PBS)，实验重复3次。并进行数据分析。

1.2.4 倒置显微镜下观察 取对数生长期细胞，胰酶消化离心后，将细胞按1×105/孔密度接种于6孔板，待细胞贴壁状态良好，对照组加入0.1% DMSO溶液，实验组加入60 μmol/L大黄素培养基处理细胞24 h，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 细胞划痕实验 取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞生长至100%时，在6孔板底部用marker笔画3条平行的直线，用100 μL枪头在6孔板中垂直均匀慢速的划线，PBS洗净划线掉落的细胞，加入不同浓度大黄素无血清培养基培养，并于24 h倒置荧光显微镜下观察划痕愈合情况，拍照储存，使用imageJ计算划痕愈合率。

1.2.6 Transwell迁移实验 取对数生长期细胞，并在无血清培养基中加入20、40、60 μmol/L大黄素溶液处理细胞，取150 μL密度为2×105/mL的处理细胞添加到上室,对照组加入0.1%DMSO溶液。下层24孔板中加含10%胎牛血清的培养基800 μL，将24孔板放置在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，24 h后吸干上室液体，用棉签小心擦去上室底部膜表面细胞，4%多聚甲醛固定Transwell小孔的底面，并用结晶紫染色20 min，显微镜下拍照并计数，统计分析各组之间的差异。

1.2.7 检测细胞周期 用胰酶消化并收集经20、40、60 μmol/L大黄素溶液处理24 h后的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入70%乙醇在4℃下固定4 h，再次使用PBS溶液洗涤2次后加入500 μL PBS(50 μg/mL溴化乙锭，100 μg/mL RNase A, 0.2%Triton X-100)于4℃培养箱中避光孵育30 min，最后进行流式细胞仪的检测。

1.2.8 TUNEL法检测B16F10细胞凋亡 将细胞爬片消毒，去离子水多次冲洗并高压灭菌，烘干后备用。将B16F10细胞按2×105/孔密度种入24孔板内，培养过夜；待细胞贴壁后，加入大黄素(60 μmol/L)，继续孵育24 h。将自然晾干的细胞爬片，采用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次,每次5 min。按凯基试剂盒说明书配制TUNEL反应液，整个过程冰上操作。滴加反应液于每张细胞爬片，使反应液完全覆盖细胞区域。37℃避光反应1 h，PBS洗3次,每次5 min。将DAPI液稀释为1 mg/L后滴加于细胞爬片，37℃避光反应15 min，PBS洗3次,每次5 min。滴加防淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察，避开周边区域，随机选取3个视野并计数，激光共聚焦显微镜下拍照储存。

1.2.9 Western blot法检测凋亡相关蛋白 当以20、40和60 μmol/L大黄素处理细胞24 h后，收集蛋白质并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将分离的蛋白质在90 V和200 mA的条件下转移到PVDF膜上，用封闭液封闭1 h。将PVDF膜在抗体稀释溶液(兔抗小鼠caspase-3和β-actin；1∶3000)中于4℃孵育过夜。然后将印迹与二抗(1∶3000)4℃避光孵育1 h，再用PBST洗膜后用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行检测。

1.3 统计学方法 所有实验均重复3次后，计量资料采用(均数±标准差)表示，采用SPSS 19.0统计软件处理数据，两组均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄素对B16F10细胞增殖的影响 用不同浓度大黄素(10、20、40、60、80 μmol/L)作用B16F10细胞24 h后，细胞存活率分别为(90.1±1.4)%、(84.1±2.3)%、(76.6±3.7)%、(71.6±1.2)%、(56.8±2.8)%，作用48 h后，细胞存活率分别为(86.1±2.7)%、(75.5±2.1)%、(63.0±4.4)%、(54.3±5.3)%、(44.8±2.7)%，表明大黄素对B16F10细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性。与对照组相比，不同浓度大黄素组均存在显著性差异(P<0.05)(图1)，且随着大黄素浓度的提升，细胞活性也随之降低，表明大黄素呈浓度依赖性的抑制B16F10细胞增殖。24 h测得IC50为131.9 μmol/L，48 h测得IC50为68.1 μmol/L。

2.2 细胞形态及数目改变 使用60 μmol/L大黄素处理B16F10细胞24 h后，对照组细胞生长状况良好，显微镜下观察呈贴壁形态不一的梭型，而大黄素组中细胞数目逐渐减少且细胞形态拉长呈现网状树突样结构。部分细胞在高浓度大黄素处理后，细胞体积缩小，固缩呈圆形(图 2)。

2.3 大黄素对B16F10细胞迁移的影响 使用梯度浓度的大黄素(20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L)分别处理B16F10细胞24 h后，实验组划痕愈合面积较对照组明显减小(图3a)，且随着浓度的增加，大黄素对B16F10细胞迁移的抑制作用更加明显，细胞横向迁移率分别为(77.4±2.1)%、(57.2±3.7)%、(40.9±3.3)%、(7.9±1.7)%(图4a)。在Transwell迁移实验中，用相同梯度浓度的大黄素溶液处理B16F10细胞24 h，显微镜下可见迁移至Transwell膜底面的细胞数较对照组均明显减少，并呈浓度依赖性改变(图3b)，实验组迁移至膜底面的细胞数分别为(400.2±10.3)、(276.3±6.6)、(163.3±8.7)、(87.7±6.1)个，较对照组具有统计学差异(P<0.05)(图4b)。

图1 不同浓度大黄素对B16F10细胞增殖的影响 注：*与对照组比较,P<0.05 图2 大黄素处理24 h后细胞形态及数目的变化(倒置显微镜，×100)

2.4 大黄素对细胞周期的影响 在对照组中大多数细胞处于G0/G1期和S期，少数细胞处于G2/M期，随着药物浓度的上升，处于G0/G1期的细胞数目开始逐渐下降。与对照组相比，大黄素组S期细胞数目减少，而G2/M期细胞数目出现升高(图5)。

2.5 大黄素对B16F10细胞凋亡的影响 使用大黄素溶液处理黑素瘤细胞24 h后，细胞经染色后置于荧光显微镜下观察，出现细胞核浓缩和核碎片的细胞被判定为凋亡细胞。对照组DAPI染色后细胞核大多规则，呈圆形浅蓝色，TUNEL着色细胞少；实验组细胞凋亡个数较对照组明显增加，凋亡细胞细胞核浓缩，或碎裂呈不规则形态，并出现点状细胞核碎片(图6)。

4a:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黄素处理24 h后，各组划痕实验细胞迁移率；4b:20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L大黄素处理24 h后，Transwell实验中各组迁移至膜底面的细胞个数。*与对照组比较,P<0.05

5a：流式细胞术检测不同浓度大黄素作用后的细胞周期分布；5b：不同浓度大黄素作用后细胞周期分布的定量分析，*与对照组比较,P<0.05

注：对照组B16F10细胞凋亡数目较少；大黄素组B16F10细胞凋亡数目增多

2.6 大黄素对细胞caspase-3蛋白水平表达的影响 caspase-3作为凋亡的执行分子对细胞凋亡有重要影响。Western blot检测结果如图7所示，这些结果表明不同浓度大黄素(40 μmol/L、60 μmol/L)处理的细胞中caspase-3的表达水平增加。 这些结果证实大黄素可能通过线粒体途径促进B16F10细胞凋亡。

注：不同浓度大黄素(40 μmol/L、60 μmol/L)处理的细胞中caspase-3的表达水平增加

3 讨论

黑素瘤增殖及侵袭能力强是导致其早期出现淋巴转移和远处转移的主要因素，且黑素瘤化疗效果差使得晚期黑素瘤患者5年生存率很低[8]。虽然这两年来个体化的靶向治疗和免疫治疗在晚期黑素瘤中取得了一定进展[9,10]，但缺乏中国患者应用免疫及靶向药物的相关数据。近来多项研究表明，大黄素可通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长，且大黄素毒性小，不良反应少，能和多种抗肿瘤药物协同作用，并能降低其肿瘤耐药性[11-15]。大黄素在16 μg/mL浓度下才对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)产生明显增殖抑制作用[16]。

诱导细胞凋亡是药物实现抗肿瘤作用的一项重要机制。有研究显示,大黄素可经线粒体途径上调caspase-9，3分子表达，从而诱导HeLa细胞凋亡。同时可通过细胞外途径上调Fas及FasL等分子表达来诱导细胞凋亡[17]。线粒体凋亡途径是实现大黄素诱导细胞凋亡的主要抗肿瘤方式[18]，大黄素作用于细胞后可导致细胞色素C释放，引起caspase-9变构活化,活化的caspase-9分子进而激活下游caspase-3等凋亡效应分子，最终引起细胞凋亡。大黄素在诱导细胞凋亡的同时可伴有细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)的失活,并能促进活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生[19]。Fang等[20]研究发现大黄素可通过下调CD155的表达从而抑制肿瘤增殖并将细胞阻滞于G2/M期。近期一项大黄素作用于黑素瘤的研究显示[16]，大黄素可以充当线粒体解偶联剂，干扰线粒体氧化磷酸化，促进活性氧产生，降低了肿瘤细胞ATP的合成，进而影响肿瘤细胞糖酵解及能量代谢，从而抑制肿瘤增殖。大黄素还可通过降低MMP2和MMP9等分子的表达，减少对细胞外基质的降解，抑制肿瘤微血管的形成进而抑制肿瘤的侵袭和转移[21]。其他研究表明，各类恶性黑素瘤均具有黑色素合成能力，大黄素作为一种天然蒽醌类衍生物，可抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的形成[22]，大黄素抗肿瘤能力也可能与其抗黑色素形成相关[23]。

本研究中，我们首先通过CCK8实验观察大黄素对B16F10细胞增殖的影响，发现大黄素呈浓度及时间依赖性抑制B16F10细胞的增殖，并将细胞阻滞于G2/M期。细胞划痕实验及Transwell迁移实验显示大黄素能有效降低B16F10细胞的迁移能力，且具有剂量依赖性。大黄素干预后引起细胞的荧光染色及细胞形态的改变，且上调了凋亡相关蛋白caspase-3的表达，表明大黄素的干预可导致黑素瘤细胞出现凋亡变化。结合文献，可以推断B16F10细胞的变化可能与大黄素作用后肿瘤细胞线粒体改变有关，是大黄素抑制黑素瘤细胞增殖，促进凋亡的主要机制之一。

本实验在不同作用条件下观察了大黄素对小鼠黑素瘤细胞B16F10的影响，实验结果提示，大黄素可有效抑制B16F10细胞增殖、迁移能力，并促进细胞凋亡。但大黄素在如何调控及促进细胞凋亡方面还有待于更深一层的研究。