三重抗生素联合氢氧化钙对粪肠球菌相关毒力因子的影响

胡 婷,王 萍

根管治疗是针对牙髓根尖周病目前的最佳疗法。而针对难治性根尖周炎，根管治疗也有失败的可能。粪肠球菌是根管治疗失败的病例中检出的常见细菌之一，与难治性根尖周炎密切相关[1,2]。粪肠球菌在饥饿期有较强生存力，其在牙本质小管中形成生物膜，对根管内的清理造成难度，释放的各种毒力因子有较强的致病性，对难治性根尖周炎的治疗带来困难[3-5]。因此,针对粪肠球菌致病性相关毒力因子的研究很有必要。本实验通过建立饥饿期粪肠球菌生物膜模型,观察新型三重抗生素(奥硝唑、米诺环素和环丙沙星)单独及联合氢氧化钙对其毒力因子如明胶酶(gelatinase，gelE),溶细胞素(cytolysin，cyl),肠球菌表面蛋白(Enterococcus surface adhesions，esp)表达的影响，为临床上提高难治性根尖周炎治疗的成功率提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 米诺环素(江苏惠氏制药有限公司)，奥硝唑(华东医药博华制药有限责任公司)，环丙沙星(江苏润邦药业有限公司)，氢氧化钙(上海第二医科大学张江生物制品公司)，BHI/BHIA培养液(青岛海博生物技术有限公司)，粪肠球菌ATCC29212(广东省环凯微生物科技有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Japan)，RNAiso Plus (TaKaRa, Japan) GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, USA)。

1.2 方法

1.2.1 饥饿期粪肠球菌生物膜的建立 用BHI液体培养液溶解粪肠球菌冻干菌粉，进行细菌复苏。对细菌进行革兰染色后显微镜下观察并鉴定。挑取复苏的粪肠球菌置于BHI液体培养液中37 ℃、5%CO2、95%N2培养48 h，进入饥饿期，取此菌液，5000 r/min离心10 min，并用PBS缓冲液重复离心2次后，用无菌PBS缓冲液将细菌浓度调整到0.5 Mc(1.5 × 108 CFU/ml)标准。将配置好的菌液接种到无菌24孔板中，在20 min内完成操作。然后将24孔板置于37 ℃、5%CO2、95%N2培养箱中连续培养48 h，24 h时更换培养液。培养48 h后在板底部肉眼可以看到有灰白色膜状物形成。

1.2.2 分组封药 用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗24孔板数次，以去除表面及周围浮游状态的细菌，随后将根管消毒药物三重抗生素糊剂(奥硝唑、米诺环素和环丙沙星等比例混合，加入无菌生理盐水配成浓度为1000 mg/ml糊剂[6]，TAP组)、氢氧化钙(与无菌生理盐水等比例调成糊剂，pH=10，CH组)、三重抗生素联合氢氧化钙(三重抗生素和氢氧化钙等比例混合，TAP+CH组)分别作用于粪肠球菌生物膜，对照组放入等量生理盐水。作用于粪肠球菌生物膜24 h后，加入0.6%硫代硫酸钠溶液终止药物的作用。生物膜样本通过在板底刮取和大力吹打取得。

1.2.3 细菌RNA的提取 将上述刚取得的样本充分震荡，吸取至EP管中，按 RNAiso Plus Total RNA提取试剂说明来提取细菌总RNA。

1.2.4 反转录反应 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反转录试剂盒，进行反转录反应。用上面步骤提取的RNA作为模板，使用 Eppendorf PCR仪进行反转录合成cDNA。实验步骤按照逆转录试剂盒说明书进行。引物的设计与合成根据Mohamed等[7]研究报道，如表1。引物设计完成后委托南京金斯瑞公司合成。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 实时荧光定量PCR 采用GoTaq® qPCR Master Mix试剂盒进行Real Time PCR反应，按照使用说明书要求进行实验操作。本实验选择20 μl反应体系:GoTaq® qPCR Master Mix(10 μl)，模板cDNA(2 μl)，PCR Forward Primer(0.4 μl)，PCR Reverse Primer(0.4 μl)，Nuclease-free Water(7.2 μl)。混匀快速离心一次。PCR反应参数如下：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。每例样品均设3个平行复孔。

计算方法：根据荧光信号，收集实验数据，测定各样品的Ct值。采用比较阈值法测定基因的相对表达量。其表达量的统计分析采用国际通用的相对定量法(2-ΔΔCT法)。计算公式：△△Ct=[Ct(目的)-Ct(内参)]待测样品-[Ct(目的)-Ct(内参)]校正样品。实验重复3次取均值。

2 结 果

TAP+CH组、TAP组、CH组和对照组，gelE、cylA和esp的表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。TAP+CH组和TAP组的gelE、cylA和esp的表达量小于CH组(P<0.05)，CH组的gelE、cylA和esp的表达量均小于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，TAP+CH组和TAP组作用的gelE、cylA和esp的表达量无统计学差异(P>0.05，表2)。

表2 不同药物作用后粪肠球菌生物膜毒力基因的表达情况

3 讨 论

牙髓根尖周病在牙髓感染炎性反应的不断发生发展下，进一步造成根尖及牙槽骨的破坏吸收，是导致失牙的主要原因之一。而感染的控制是根管治疗成功的关键。目前在根管治疗失败病例中残留的感染细菌主要有粪肠球菌、牙龈卟啉单胞菌、微小消化链球菌、中间普氏菌、产黑素杆菌和衣氏放线菌等[1,8,9]。其中粪肠球菌在失败病例中呈高检出率，Rocas等[10]在根管治疗失败病例中对粪肠球菌的检出率高达77%。

粪肠球菌普遍存在于自然界，一般较常见于各种动物的肠道，也是人体上呼吸道，肠道的常居菌。粪肠球菌的感染可引起脑膜炎、心内膜炎、胆囊炎、尿路感染及伤口感染等多种全身疾病。它是兼性厌氧革兰阳性细菌，同时与根管治疗失败密切相关。有研究表明粪肠球菌在根管内顽固残留可能与其营养需求低、能独自存活、耐受高pH值和极易侵入牙本质小管有关[11-13]。

粪肠球菌形成生物膜的能力使其具有浮游状态下所没有的生存优势,包括抵抗宿主防御机制、耐受抗生素、对抗恶劣低营养环境和毒力的增强[14]。其释放的毒力因子如gelE、cyl、esp、丝氨酸蛋白酶(serine proteinase)和黏附素(adhesin)等对其致病机制、宿主免疫应答和生物膜的形成有着重要的关系[3,4,12]。因此，对粪肠球菌毒力因子作用的深入研究对难治性根尖周炎的防治有着重要的作用。

目前，与粪肠球菌生物膜形成相关的毒力因子主要有esp、gelE、cylA和聚集物质(AS)等。esp是粪肠球菌分子量最大的表面蛋白质，研究认为其与粪肠球菌生物膜的形成显著相关，它能促进粪肠球菌在生物膜中细菌之间的黏附并且能促使细菌对非生物组织表面的附着[12]。gelE是一种含锌的胞外基质金属蛋白酶，它能够水解明胶、酪蛋白、胶原、血红蛋白和其他生物活性物质来获得存活所需要的肽营养。研究发现gelE与生物膜的形成密切相关，Mohamed等[15]发现，在敲除gelE基因的情况下，粪肠球菌生物膜形成能力下降[7]。cylA是粪肠球菌感染最重要的致病物质之一，它同时具有杀细胞和溶血活性。由于根管治疗失败的病例中粪肠球菌大多处于饥饿期，故本实验选用饥饿期粪肠球菌生物膜进行研究。

基于粪肠球菌在难治性根尖周炎中不可忽视的影响，目前对其抗菌药物的研究越来越多，寻找有效针对粪肠球菌的根管消毒药物至关重要[16-18]。本实验中采用了由奥硝唑，环丙沙星和米诺环素组成的新型三重抗生素(传统抗生素组成：甲硝唑、环丙沙星和米诺环素[19])。其中奥硝唑作为第三代硝基咪唑类药物，具有对厌氧菌和原核生物的广谱杀菌作用，其作用较甲硝唑强，有很强的渗透性，可以深入渗透根管系统，深层次作用于残余细菌；米诺环素有和四环素类似的抗菌谱；环丙沙星可以抑制细菌的DNA旋转酶，促进成纤维细胞的形成[20-23]。3种药物的联合使用能提高其抗菌效果。氢氧化钙是目前临床上最常用的消毒药物，但对难治性根尖周炎效果欠佳[22 ,24]。本实验中用氢氧化钙与新型三重抗生素配伍使用作用于粪肠球菌，观察其对粪肠球菌致病毒力因子的影响。

本研究采用实时荧光定量PCR对粪肠球菌生物膜毒力因子gelE、cylA和esp的相对表达量进行检测。实验结果表明在作用粪肠球菌生物膜时，TAP+CH、TAP和CH均显著抑制毒力因子gelE、cylA和esp的表达；TAP+CH和TAP对这三种毒力基因表达的抑制作用均强于CH。这可能与其对粪肠球菌相关毒力基因片段的转录与表达进行了干扰有关，从而能对粪肠球菌生物膜的形成起到一定的抑制作用。

粪肠球菌作为难治性根尖周炎的重要致病菌，它可以在根管内形成生物膜，使其难于被清除，而释放的毒力因子使根尖周病变久不愈合。本研究结果可为防治难治性根尖周炎的发生提供一定的理论及实验依据。但三重抗生素联合氢氧化钙对其具体作用机制尚需进一步研究。