苁蓉益肾颗粒治疗糖尿病肾病的潜在作用机制

蔡文玺，李 浩，石 磊，张 磊

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病，尤其是2型糖尿病所致的慢性肾脏疾病，是糖尿病主要的微血管并发症之一，最终可发展为终末期肾病 (end-stage renal disease，ESRD)[1-2]。根据2019中国糖尿病肾病防治指南，与未合并DN的糖尿病患者相比，DN患者的死亡率更高，且大部分死亡是由于心血管事件导致[3]。然而，尽管一些治疗方法可以缓解糖尿病肾病的症状，包括严格控制血糖、血压，给予血管紧张素转换酶抑制剂，抑制肾素-血管紧张素系统等，但疗效仍不理想[4，5]。而作为中药复方制剂的苁蓉益肾颗粒主要由五味子、菟丝子、肉苁蓉、茯苓、车前子、巴戟天等中草药制成，具有补肾填精之功效[6-8]，在DN的治疗中有着积极的作用，但是其主要药效成分、作用机制仍不明确。本研究基于网络药理学策略，预测了苁蓉益肾颗粒治疗DN的作用机制，揭示药物与生物系统相互作用的内涵，有助于理解中药整体的多靶点、多途径网络的协同调控模式，为中药活性成分的筛选及其多靶点作用机制的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 苁蓉益肾颗粒主要化学成分的收集和筛选 借助中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[9]，以 “五味子”、“菟丝子”、“肉苁蓉”、“茯苓”、“车前子”、“巴戟天”为关键词检索苁蓉益肾颗粒中的化学成分。结合药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄的相关性质及TCMSP中建议的筛选标准，以口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18为限制进行活性成分的筛选。

1.2 苁蓉益肾颗粒主要化学成分潜在作用靶点的收集 借助TCMSP数据库，检索上述所有候选活性成分对应的靶点信息，并通过UniProt数据库进行进一步筛选，通过输入靶蛋白名称，并限定物种为“Homo sapiens”，剔除非人源靶点，将所有蛋白名校正为其官方名称。

1.3 DN疾病靶点的收集 以“diabetic nephropathy”、“diabetic kidney disease”为关键词分别检索TTD[10], OMIM[11], DisGeNET[12], Drugbank[13], PharmGkb[14], CTD[15], Genecard[16]等数据库，去除重复基因，得到疾病对应的靶点数据集。

1.4 生物分子网络构建及分析 基于上述靶点信息，通过Cytoscape 3.7.1[17]软件构建中药-成分、主要成分-靶点网络，从而显示中药多成分、多靶点的作用特点。

比对主要活性成分靶点和疾病靶点，确定靶点交集，借助STRING v10.5数据库[18]构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)网络，寻找靶点和靶点间作用关系。通过Network Analyzer对PPI网络进行网络拓扑特性分析，包括度、介数中心度(betweenness centrality, BC)和接近中心度(closeness centrality, CC)，选取大于上述参数中位数的靶点作为关键靶点，其在网络中信息传递效率更高，能影响更多节点，在网络中作用显著。

1.5 信号通路富集分析 采用Cytoscape 3.7.1软件插件ClueGO[19]对上述靶基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析，综合预测苁蓉益肾颗粒与DN关键靶点的生物学过程及调控通路，基于富集结果的P值，以P<0.05为筛选条件，P<0.01被认为是显著富集，根据从小到大的顺序对P值进行排序。

2 结 果

2.1 苁蓉益肾颗粒主要化学成分的收集和筛选 首先，通过TCMSP数据库对苁蓉益肾颗粒主要化学成分进行检索，根据OB(≥30%)与DL(≥0.18)阈值，最终共得出69个活性成分(图1)。其中，五味子8个，菟丝子11个，肉苁蓉6个，茯苓15个，车前子9个，巴戟天20个，见图1。

图1 苁蓉益肾颗粒主要化学成分网络

2.2 苁蓉益肾颗粒主要化学成分潜在作用靶点的收集 通过TCMSP数据库检索得到苁蓉益肾颗粒化学成分对应的1117个作用靶点，其中五味子30个，菟丝子343个，肉苁蓉223个，茯苓30个，车前子195个，巴戟天296个，通过Cytoscape3.7.1软件将苁蓉益肾颗粒主要化学成分与靶点相连，绘制出“中药活性成分-潜在作用靶点”可视化相互作用网络图。

该网络由269个节点和549条边组成，且普遍存在1个活性成分作用于多个靶点以及多个活性化学成分对应1个靶点的现象，从而说明了苁蓉益肾颗粒治疗作用的多靶点属性。而潜在靶点PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PIK3CG等因较高的自由度在网络中发挥着重要作用，这也表明了苁蓉益肾颗粒在发挥药效过程中不同成分间的综合协同作用模式。

2.3 DN疾病靶点的收集 通过TTD、OMIM、DisGeNET、Drugbank、PharmGkb、CTD、Genecard数据库收集DN相关靶点基因，去除重复基因，共得到311个疾病对应的靶点数据集。

2.4 生物分子网络构建及分析 比对主要活性成分靶点和疾病靶点，取其靶点交集，共得到81个活性成分和DN疾病共有靶点。通过STRING数据库构建PPI，寻找靶点和靶点间作用关系。通过Network Analyzer对PPI网路进行分析得，BC中位数为0.002827，CC中位数为0.6093，度的中位数为30.5。基于网络药理学筛选方法，筛选上述拓扑学参数值大于中位数的靶基因作为关键靶点，共37个，见表1。

2.5 信号通路富集分析 采用ClueGO插件对上述关键靶基因进行GO和KEGG信号通路富集分析，综合预测苁蓉益肾颗粒与DN关键靶点的生物学特性及调控通路。

GO富集分析表明，苁蓉益肾颗粒可能通过对脂多糖的反应、对活性氧的反应、氧化应激、凋亡、细胞增殖等352个显著生物过程发挥作用。KEGG功能注释富集分析提示，该中药复方可能作用的信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、癌症途径、Toll样受体信号通路、细胞凋亡等94个。上述信息表明，苁蓉益肾颗粒可通过调节多个生物过程及多个通路的协调发挥治疗DN的作用。同时，KEGG富集显示疾病之间的调控机制存在相互联系、相互影响的关系。富集分析表明，包括不同类型的病毒感染、乙型肝炎、恰加斯病(美国锥虫病)、百日咳、弓形虫病等疾病也被显著富集。进一步对KEGG富集分析结果进行可视化处理。

表1 苁蓉益肾颗粒治疗DN关键靶点

3 讨 论

DN是糖尿病患者最重要的合并症之一，目前已成为终末期肾脏病的第二位原因，仅次于肾小球肾炎。中医理论认为，DN归属为中医“消渴”、“水肿”等范畴，其基本病机为气阴两虚，消渴日久，燥热伤阴，阴损及阳。故在治疗上多以益气养阴、活血化瘀等方法进行治疗[20]。中药复方苁蓉益肾颗粒主要由肉苁蓉、五味子、菟丝子、茯苓、车前子、巴戟天等中草药制成。其中，肉苁蓉甘酸咸温，既能补肾壮阳，又能益精填髓，为君药；巴戟天辛甘微温，补益肾气，强筋壮骨，菟丝子辛甘平，滋补肾阴，固精养血，滋补肾阴，二者共为臣药，增强肉苁蓉之补益肾气之力，特别是菟丝子多糖还具有较好的降血糖作用[21]；五味子能敛肺益肾，固摄精微，茯苓甘平，健脾渗湿利水，二者合而为佐药；车前子甘寒通淋，利水消肿，以制五味子、菟丝子过于涩精，且引诸药入肾，为使药；全方共奏补肾填精，滋阴补气之功效。

本研究旨在探索苁蓉益肾颗粒潜在的分子生物学机制，通过比对主要活性成分靶点和疾病靶点，构建主要成分靶点与DN疾病靶点交集的PPI网络，最终筛选得到37个关键靶点，包括AKT1、IL-6、TNF、VEGFA等。有研究表明，AKT1是细胞内信号传导系统中重要的丝/苏氨酸蛋白激酶，其异常表达和激活可引起过度的细胞外基质在间质沉积，启动并维持DN慢性肾纤维化发生发展[22]； IL-6、TNF-α及VEGFA是2型糖尿病肾病发生的重要炎症反应介质，病理情况下，高水平的VEGFA及 IL-6、TNF-α等炎性因子的释放过度，造成了肾小球病理变化加剧，其组织功能和结构也发生了异常变化[23]。

生物过程及信号通路富集共筛选出94条显著信号通路及352个显著生物过程，表明苁蓉益肾颗粒可能通过对炎症反应、对活性氧的反应、氧化应激、凋亡、细胞增殖等生物过程，以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、癌症途径、Toll样受体信号通路、细胞凋亡等多个信号通路协同发挥治疗DN的作用，这些信号通路及生物过程目前已经证明与DN相关。AGE-RAGE信号通路是糖尿病肾病发生发展的重要一环，其在糖尿病肾病中的作用机制体现在激活NF-κB，引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子(如IL -6、IL-8、TNF-α) 等的表达和释放，最终引起慢性细胞活化和组织损伤[24]，该通路还可刺激产生VEGF，从而增加血管的通透性，引起蛋白尿。而DN是一种代谢紊乱引起的炎性反应疾病，炎症因子的释放增多可促进巨噬细胞浸润，肾小管纤维化，最终导致肾小球硬化加速[25]。其中，TNF-α 是一种重要的多功能免疫细胞因子，参与许多炎性、传染性和自体免疫性疾病的发生发展过程[26]。它还可以刺激内皮细胞和单核细胞分泌IL-6、IL-1β等炎症因子，从而进一步放大或间接增强其毒性作用[27]。 临床研究结果显示，苁蓉益肾颗粒在降低血糖的同时，可显著降低患者血清TNF-α、IL-6等炎症因子水平[6]。这也佐证了苁蓉益肾颗粒可能是通过干预人体AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路，参与到炎性反应生物过程来控制和改善DN患者的病情。

另外，生物过程和信号通路富集分析显示，苁蓉益肾颗粒也可以参与到对活性氧的反应、氧化应激生物过程之中。研究表明，机体高活性分子活性氧簇ROS产生过多，超出了机体对氧化物的清除能力，可以引起肾小球基底膜结构改变、肾小球毛细血管通透性增高，最终导致肾小球纤维化，使肾脏的损害更加严重，促进DN的发生和发展[28-30]。有报道称，苁蓉益肾颗粒可改善膀胱颈部位肌肉细胞内线粒体的能量代谢功能，增强尿道内括约肌的收缩力，同时对机体交感祌经的损伤也有一定的保护作用，从而达到改善肾功能的作用[31]。

本研究基于模块化网络分析对苁蓉益肾颗粒作用机制进行了初步的探索，通过已有研究结果也证明了其预测相关生物过程及信号通路的准确性。根据研究结果分析，其药理机制可能是通过控制血糖浓度，影响AGEs-RAGE 、TNF、Toll样受体等多信号通路，调节机体炎症反应、对活性氧的反应、氧化应激反应等生物学过程而干预DN。本研究为更快、更好地理解苁蓉益肾颗粒的作用机制提供了一条有效的途径，为进一步实验研究提供了理论支持，并可以从分子水平的功能模块来说明中医“协同”的科学内涵。