微小RNA-337-3p在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

张星明，顾文莉

（上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科，上海 200011）

口腔癌是较常见的头颈部恶性肿瘤之一，每年全世界有新发患者52.9万例，其中我国占8.7%，并呈现逐年增多的趋势[1]。口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔癌最主要的病理学类型，占口腔癌的90%以上[2]。近年来，随着OSCC诊疗手段的不断进步，OSCC患者的预后已有较大改善，但5年生存率仍低于60%，且手术治疗带来的面部畸形、语言障碍、咀嚼及吞咽困难等严重影响着患者的生存质量[3-4]。目前研究表明，烟草、酒精、咀嚼槟榔及病毒感染等因素与OSCC发生、发展间关系密切，但OSCC发生及进展过程中的具体分子机制尚未明确[5-6]，仍需进一步探索。

微小RNA（microRNA,miRNA）是一类单链、非编码、长度在20～22个核苷酸的小RNA，可以与靶基因mRNA的3′非翻译区序列互补结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，进而影响多种细胞活动，例如细胞增殖、分化及凋亡等[7]。此外，miRNA作为重要的生物学标志物，在肿瘤诊断及预后监测等方面发挥重要作用，可在一定程度上预测患者的生存、复发及对化疗药物的敏感性[8-10]。例如，miRNA-34b-3p可靶向CDK4，从而促进非小细胞肺癌细胞的增殖抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡[11]。此外，血清中miRNA-27a的表达水平可作为潜在的灵敏且特异的分子标志物，用于早期原发性乳腺癌的检测[12]。

据文献报道，miRNA-337-3p在胃癌细胞系中低表达，并与胃癌细胞淋巴结转移状况密切相关[13]。此外，miRNA-337-3p可抑制酪蛋白激酶Ⅱ的表达来加速结肠直肠癌细胞的衰老[14]。Xiang等[15]的研究表明，miRNA-337-3p在神经母细胞瘤组织及细胞系中低表达，可与基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase-14,MMP-14）的启动子序列结合而抑制细胞转录，进而影响肿瘤细胞的生长、侵袭、转移及血管生成等过程。随着研究的深入开展，miRNA-337-3p在肿瘤发生及进展过程中的作用机制逐渐明确，然而，关于其在OSCC中发挥的作用目前尚无研究报道。因此，本研究拟分析miRNA-337-3p在OSCC组织及细胞系中的表达情况及其对OSCC细胞迁移能力的影响，以期为OSCC侵袭、转移的早期诊断及预后监测提供依据及帮助。

材料与方法

一、细胞及主要试剂

实验用OSCC细胞系 （HN4、HN6、HN30及CAL27）及作为对照的正常人口腔角质形成细胞（human oral keratinocyte,HOK）均来自上海交通大学医学院附属第九人民医院上海市口腔医学重点实验室。实验所用试剂包括胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素溶液、总RNA抽提试剂、miRNA实时荧光定量PCR检测试剂盒 （上海诺伦生物医药技术有限公司），miRNA类似物阴性对照 [miRNA mimic negative control（NC）]、miRNA抑制物阴性对照 （miRNA inhibitor NC）、miRNA-337-3p类似物（miRNA-337-3p mimic）及 miRNA-337-3p抑制物 （miRNA-337-3p inhibitor）、miRNA转染试剂（广州锐博生物科技有限公司）。

二、OSCC组织标本的收集

收集2018年于上海交通大学医学院附属第九人民医院行口腔颌面外科手术切除的20例OSCC患者的肿瘤组织标本，并以同一患者的癌旁邻近正常口腔上皮组织作为对照。术后病理检查证实肿瘤组织为OSCC、癌旁组织为正常口腔上皮组织（癌旁正常组织）。所有患者均签署知情同意书，标本收集均经我院生命科学伦理学审查委员会批准。本研究的纳入标准如下。①病理检查确诊为原发性OSCC；②患者均为初发病例；③术前均未接受放射治疗、化学治疗。排除标准如下。①合并其他部位的恶性肿瘤患者；②存在严重心、肝、肺功能障碍者；③临床资料不完整者。手术切除的组织经生理盐水漂洗、滤纸吸水后，装入冻存管，置于液氮中保存。

三、OSCC组织的总RNA提取、实时荧光定量反转录PCR

采用Trizol法抽提OSCC组织及其癌旁正常组织的总RNA，严格按照说明书进行操作。采用1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，用紫外分光光度法检测RNA的浓度及纯度。观察18 S、28 S电泳条带，如条带清晰、泳道内没有拖尾，且28 S条带亮度是18 S条带亮度的2倍及以上，提示RNA样品完整性较好。选取完整性尚好且吸光度（absorbance，A）260mm/A280mm比值在1.8～2.0之间的样品进行反转录PCR。严格按照试剂盒说明书配制反转录体系20 μL。反应条件为，第一步，16 ℃30 min；第二步，42 ℃45 min；第三步，85 ℃10 min。将反转录反应制备的cDNA取出2 μL作为模板进行PCR反应。反应条件为，94 ℃3 min，1个循环；94 ℃15 s，62 ℃40 s，共40个循环。miRNA-337-3p及U6的实时荧光定量PCR引物序列由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。所得原始数据采用相对定量2-ΔΔCt方法进行分析，使用内参U6，对miRNA-337-3p相对表达量进行标准化处理。

四、细胞培养

OSCC细胞系（HN4、HN6、HN30及CAL27）使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，HOK使用口腔角质形成细胞培养基 （上海康朗生物科技有限公司）培养，培养条件均为37 ℃及5%CO2。细胞均为贴壁生长，密度达到70%时进行传代培养，使用胰酶消化法制备细胞悬液，用锥虫蓝染色活细胞并进行细胞计数。

五、miRNA-337-3p类似物及抑制物的转染

转染前1天，选取生长状态良好的HN30细胞接种至6孔板内，以转染时细胞密度达到50%为宜。以转染miRNA-337-3p类似物为例，步骤如下。首先，用120 μL转染缓冲液稀释5 μL 20 μmol/L miRNA-337-3p类似物，轻轻吹打混匀；再加入12 μL riboFECTTMCP转染试剂，轻轻吹打混匀，室温孵育15 min。将上述制备的混合液加入到无双抗完全培养基中，轻轻混匀，将6孔板置于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h。

六、细胞划痕试验

在6孔板中分别铺种转染特定浓度的miRNA-337-3p类似物及抑制物的HN30细胞，待细胞长满之后，用10 μL的小枪头以相同的力度划一直线，以不含血清的DMEM培养细胞，在0 h时，首先在显微镜下拍下划痕的初始状态，并记录拍摄的位置后将细胞置于培养箱中培养，每隔12 h在初始拍摄位置处重复拍摄。根据拍摄后的图计算迁移率，细胞48 h迁移率（%）=（初始宽度-48 h后的宽度）/初始宽度×100%。

七、蛋白质印迹法检测

经过不同处理的细胞均采用十二烷基硫酸钠裂解后，经10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解后的蛋白产物，并转移至硝酸纤维素膜，转膜后用丽春红预染，观察蛋白条带是否完整。以5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，加入抗基质金属蛋白酶14 （matrix metalloproteinase-14，MMP-14）抗体（1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜；用含吐温的磷酸盐缓冲液洗膜10 min，共3次；加入抗鼠二抗（1∶10 000稀释）后在室温孵育1 h，洗膜后使用化学发光分析仪显影并拍照。

八、统计学处理

数据结果均进行正态分布检验，符合正态分布的计量资料以平均值±标准差表示。统计分析使用SPSS 17.0软件完成。不同组间miRNA-337-3p的表达水平比较采用两独立样本t检验，miRNA-337-3p的表达水平与OSCC患者临床病理参数的相关性分析采用Fisher′s精确检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、miRNA-337-3p在OSCC组织中表达下调

采用实时荧光定量反转录PCR法检测20例原发性OSCC患者的肿瘤组织及其癌旁正常组织标本中miRNA-337-3p的表达水平。结果发现，相较于配对的癌旁正常组织，有19例（95%）OSCC组织中的miRNA-337-3p表达下调（见图1A）。对这20例样本的miRNA-337-3p平均表达水平进行统计学分析发现，miRNA-337-3p在OSCC组织中的表达水平较癌旁正常组织显著下调（见图1B）（P＜0.000 1）。

二、miRNA-337-3p的表达与OSCC患者临床病理参数间的关系

为进一步探索miRNA-337-3p在OSCC中的影响机制，本研究以20例OSCC患者miRNA-337-3p相对表达量的平均水平为标准，将相对表达量低于平均水平的定为miRNA-337-3p低表达组，将miRNA-337-3p的表达水平与OSCC患者的临床病理参数进行关联系分析，结果表明，miRNA-337-3p的表达量与OSCC患者淋巴结转移状况显著相关（P＜0.05），发生淋巴结转移（N1+N2）者OSCC组织中miRNA-337-3p的表达水平显著低于未发生淋巴结转移者（N0）（见图2）。不同年龄、性别、吸烟或饮酒状态、病理分级等患者间的OSCC组织miRNA-337-3p表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

图1 定量反转录PCR检测20例OSCC组织及其癌旁正常组织中miRNA-337-3p的表达水平

图2 miRNA-337-3p在发生淋巴结转移的OSCC组织中表达下调

表1 miRNA-337-3p表达水平与OSCC患者临床病理参数的关系

三、miRNA-337-3p在OSCC细胞系中表达情况

定量反转录PCR检测了一系列OSCC细胞系及正常HOK中miRNA-337-3p的表达水平。在4种OSCC细胞系中，HN4、HN6及CAL27细胞来源于未发生转移的OSCC患者，HN30细胞来源于发生局部淋巴结转移的OSCC患者。结果如图3所示，与正常HOK相比，HN30中miRNA-337-3p的表达下调（P＜0.01），而HN4、HN6及CAL27中miRNA-337-3p的表达无变化。

图3 定量反转录PCR检测OSCC细胞系及正常HOK中miRNA-337-3p的表达情况

四、miRNA-337-3p对HN30细胞迁移能力的影响

为明确miRNA-337-3p在OSCC中的影响机制，本研究在HN30细胞中瞬转miRNA-337-3p类似物及抑制物，用划痕试验检测miRNA-337-3p对HN30细胞迁移能力的影响。划痕试验检测结果发现，miRNA-337-3p能显著影响HN30细胞的迁移能力，过表达miRNA-337-3p能使细胞迁移能力下降，抑制miRNA-337-3p表达后，细胞迁移能力上升（见图4）。

五、miRNA-337-3p影响HN30细胞迁移能力的相关分子机制

本研究在HN30细胞中瞬转miRNA-337-3p类似物及抑制物，行蛋白质印迹法检测结果发现，过表达miRNA-337-3p，MMP-14表达下降；反之，抑制miRNA-337-3p的表达，MMP-14的蛋白表达水平随之升高（见图5）。

图4 miRNA-337-3p对HN30细胞迁移能力的影响

图5 蛋白质印迹法检测miRNA-337-3p对MMP-14蛋白表达水平的影响

讨论

OSCC恶性程度高，进展迅速，目前针对临床OSCC患者的主要治疗手段仍是手术，但患者预后不佳，5年生存率不足60%。越来越多的研究表明，miRNA在OSCC发生及进展过程中发挥至关重要的调控作用[21]，因此，深入探索OSCC中miRNA的表达变化及其对OSCC发生、发展的影响机制具有重要意义。

一、miRNA-337-3p在OSCC中的表达变化

据文献报道，miRNA-337-3p在胃癌、神经母细胞瘤、肾癌及宫颈癌等多种类型的肿瘤组织中低表达，但其在OSCC中的表达变化及其发挥的调控功能目前尚无研究报道。本研究发现，miRNA-337-3p在OSCC组织中显著低表达，提示其可能作为抑癌因子在OSCC发生及进展过程中发挥抗肿瘤效应。本研究结果来源于OSCC患者的组织标本，能客观、真实反映疾病实际情况。

二、miRNA-337-3p表达水平与OSCC患者淋巴结转移情况间的关系

局部淋巴结转移是OSCC最主要的生物学行为之一，也是影响患者预后的一大重要因素。据文献报道，OSCC患者的转移率约为40%[22]。OSCC的侵袭及转移过程是涉及多因素、多环节调控的复杂渐进过程，其确切分子机制尚未完全被阐明，仍需进一步探索。本研究表明，miRNA-337-3p的表达量与OSCC患者淋巴结转移状况显著相关（P＜0.05），发生淋巴结转移者 （N1+N2）OSCC组织中miRNA-337-3p的表达水平显著低于未发生淋巴结转移者（N0），此外，由发生淋巴结转移的OSCC组织分离得到的HN30细胞，其miRNA-337-3p的表达水平较低，这些结果提示miRNA-337-3p的低表达可能促进OSCC细胞的侵袭及转移过程。

三、miRNA-337-3p对OSCC细胞迁移能力的影响及相关分子机制探索

研究表明，miRNA-337-3p通过直接靶向钙蛋白酶小亚基1的3′非翻译区序列，进而抑制肾癌细胞的增殖及转移[23]。此外，在宫颈癌细胞中，miRNA-337-3p可在转录后水平抑制Ras相关蛋白A1的表达，最终引起宫颈癌细胞侵袭及迁移能力减弱[24]。本研究观察miRNA-337-3p对OSCC细胞迁移能力的影响上，也得到了相似的结果，miRNA-337-3p可使OSCC细胞迁移减慢。然而，肿瘤细胞的迁移及侵袭过程密不可分，为验证miRNA-337-3p对肿瘤细胞侵袭能力的影响，可设计Transwell小室细胞体外侵袭实验进行进一步探究，这也是有待今后完善的地方。

此外，蛋白质印迹法结果表明，在OSCC细胞中，miRNA-337-3p可影响MMP-14的蛋白表达水平。上皮间质转化在肿瘤的发生及侵袭、转移过程中起关键作用，而MMP-14在上皮细胞向间充质细胞转化的过程中发挥至关重要的调控作用[25]。然而，miRNA-337-3p是否仅通过调控MMP-14的表达进而影响OSCC细胞的侵袭及转移过程，抑或是存在miRNA-337-3p调控的其他靶基因影响这一过程，仍需进一步探索。

总之，本研究发现miRNA-337-3p在OSCC中呈低表达，并与患者淋巴结转移关系密切。miRNA-337-3p在OSCC中可能发挥抑癌作用，有望成为OSCC侵袭、转移的早期诊断及预后监测的潜在标志物。