莱阳茌梨渣总黄酮的提取及其抗氧化性研究
2020-12-01马进孙芬芳周霞阮绪文张淼
马进,孙芬芳,周霞,阮绪文,张淼
(青岛农业大学海都学院食品系,山东莱阳265200)
梨是我国主要水果之一,素有“梨乡”美誉的莱阳,其主要种植品种——茌梨是山东梨类传统名贵品种之一[1]。梨果除了以鲜果消费外,其加工产品众多,如浓缩梨汁、梨膏等。随着梨加工产业的发展,其加工副产物梨渣的产出也逐年增加。梨渣富含黄酮[2]、多糖[3]、多酚[4]、果胶[5]、酯类物质[6]、酸类物质[7]和膳食纤维[8-9]等多种功能性营养成分,对这些功能性物质进行提取利用,是增加梨果附加值、提高梨产业综合产值的有效途径。国内外学者在这方面做了很多有益的尝试。陈树俊等[3]采用超声辅助法提取了黄梨渣中的多糖并对其进行了分离纯化和结构鉴定;赵国群等[10]对超声波辅助提取梨渣中酯类物质的工艺研究进行了的报道。邹兰等[11]报道了苹果梨渣膳食纤维的碱法制备工艺并对其物化特性进行研究;You等[12]探索了梨渣水提物对大鼠肝脏脂质过氧化的保护作用,结果表明梨渣水提物是一种有价值的天然抗氧化剂,可用于保健食品工业。
黄酮类物质因具有抗氧化[13-15]、抗肿瘤[16-17]、抑菌[18-19]、降糖[20]、抗衰老[21-24]等多种生物活性而受到广泛关注,然而从梨渣中提取黄酮的研究鲜见报道。本文拟采用响应面法对超声辅助提取梨渣中黄酮类物质的工艺进行优化,并探索其抗氧化性,以期为莱阳梨资源的综合利用提供一定的技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
莱阳茌梨渣:由莱阳当地的梨汁生产厂提供;芦丁标准品(纯度≥98%):中国食品药品检定研究院;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):上海展云化工有限公司;铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等(分析纯):国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外-可见分光光度计(TU-1901):北京普析通用仪器有限责任公司;电子分析天平(BSA224S-CW型):德国赛多利斯集团;超纯水机(FBZ2002-UP-P型):青岛富勒姆科技有限公司;超声波清洗机(SB-4200DTN):宁波新芝生物科技股份有限公司;台式离心机(800B):上海安亭科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄酮标准曲线的绘制
本试验采用亚硝酸钠—硝酸铝分光光度法对提取液的黄酮含量进行测定,通过与芦丁标准曲线的吸光度值进行对比,得到提取液内的黄酮类物质含量,计算得率[24]。准确称取干燥恒重的芦丁标准品0.126 g,30%的乙醇定容于100 mL容量瓶中,摇匀备用。吸取芦丁标准液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分别置于50mL容量瓶中,各加入30%的乙醇使其体积为25mL;然后加入质量分数为5%的NaNO2溶液1.5 mL摇匀,放置6 min;加入10%的Al(NO3)3溶液1.5 mL摇匀,放置6 min;加1 mol/L的NaOH溶液20 mL,30%乙醇定容至刻度并摇匀,放置15 min。以空白为对照,于510 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标,芦丁浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程y=0.010 19x-0.223 95,R2=0.999 8。
1.3.2 莱阳茌梨渣总黄酮的提取
将梨渣自然晾干,用粉碎机粉碎,过60目筛,储存于棕色广口瓶中备用。准确称取梨渣粉1 g(精确至0.01 g),按照不同料液比要求加入乙醇溶液,摇匀,放在超声波清洗器中进行超声波辅助提取,提取完成后离心分离,收集上清液,定容后测定提取液中的总黄酮浓度,按公式计算梨渣中总黄酮提取量。
1.3.3 单因素对黄酮提取量的影响
考察单因素乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%),超声温度(30、40、50、60、70℃),液料比[(10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1(mL/g)],超声时间(20、30、40、50、60 min)对梨渣黄酮提取量的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验结果基础上,采用Box-Behnken方法进行响应面试验设计。本试验以总黄酮提取量为响应值,选取A超声温度、B超声时间、C乙醇体积分数、D液料比四因素三水平进行试验设计。
表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design
1.3.5 抗氧化性研究
1.3.5.1 还原能力的测定
参考邓梦琴等[23]的方法稍作修改。取不同质量浓度的样品1 mL,加入0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2 mL和质量分数1.0%的铁氰化钾溶液2 mL,混匀,在50℃水浴20 min后,加入10%三氯乙酸溶液2 mL,混匀后5 000 r/min离心10 min,取上清液2 mL加入2 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数0.1%三氯化铁溶液,反应10 min后,在700 nm波长处测定其吸光度,平行测定吸光度3次,以蒸馏水调零。吸光度越大表示其还原力越强。
1.3.5.2 DPPH自由基清除率
参照徐柯等[2]使用的方法,并在此基础上进行少量改动。向2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中加入不同质量浓度的黄酮提取液2.0 mL,避光反应25 min后,于517nm波长处测吸光度记为Ai,同时测定2.0mL无水乙醇溶液与2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度记为Ac,及2.0 mL无水乙醇与不同质量浓度的黄酮提取液2.0 mL混合液的吸光度记为Ab。清除率计算公式如下。
1.4 数据处理
利用Microsoft Excel2016对单因素试验数据作图并利用Design-Expert8.0.6进行响应面试验设计及分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声温度对莱阳茌梨渣中总黄酮提取的影响
超声温度对莱阳茌梨渣中总黄酮提取的影响见图1。
图1 超声温度对总黄酮提取量的影响Fig.1 Effectofultrasonictemperatureontotalflavonoidextraction
由图1可知,当超声温度为30℃~50℃时,总黄酮提取量随着超声温度的升高而升高,当温度达到50℃时,总黄酮提取量达到最大,为5.03 mg/g。当超声温度高于50℃,总黄酮提取量反而降低,这可能由于温度升高导致分子运动增加,使黄酮与溶剂接触增加,更易溶于溶剂中,故总黄酮提取量增加,但温度太高的话,会导致部分黄酮氧化,使测定的黄酮浓度降低。因此将超声温度设定为50℃。
2.1.2 超声时间对莱阳茌梨渣中总黄酮提取的影响
超声时间对总黄酮提取量的影响见图2。
图2 超声时间对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on total flavonoid extraction
由图2可知,超声时间在20 min~40 min时,总黄酮提取量随着超声时间延长而明显增加,超声时间为40 min时,总黄酮提取量达到最大5.25 mg/g;提取时间超过40 min时,总黄酮提取量随着时间的增加反而呈现下降趋势,这可能是由于乙醇具有挥发性,时间越久乙醇浓度越小,提取溶剂极性变大,导致小部分极性小的黄酮类化合物从溶液中析出,降低提取液中黄酮的浓度。因此将超声时间设定为40 min。
2.1.3 乙醇体积分数对莱阳茌梨渣中总黄酮提取的影响
乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响见图3。
图3 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction
由图3可知,当乙醇浓度小于60%时,所提取总黄酮提取量随着乙醇浓度增大而增加,当乙醇浓度达到60%时,总黄酮提取量到达顶峰,为5.12 mg/g。当乙醇体积分数大于60%时,总黄酮提取量迅速下降,这可能因为当乙醇浓度达到一定程度之后可能会影响黄酮类溶解性及其醇溶性杂质、色素增多,这些杂质会与黄酮竞争溶剂,导致黄酮类化合物的溶解度降低。因此将乙醇体积分数设定60%。
2.1.4 液料比对莱阳茌梨渣中总黄酮提取的影响
液料比对总黄酮提取量的影响见图4。
图4 液料比对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on total flavonoids extraction
由图4可知,总黄酮提取量随着液料比的增加而增大,当液料比 40∶1(mL/g)时达到最大为 5.22 mg/g,之后随着液料比的增加总黄酮提取量呈现下降趋势,其原因可能是随着液料比的增大,黄酮中的其他成分也会溶出或者部分黄酮类化合物与溶剂长时间接触会导致结构破坏,使得总黄酮提取量降低,因此将液料比设定为 40 ∶1(mL/g)。
2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面回归模型建立与分析
Box-Behnken试验设计与结果见表2,方差分析见表3。
表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results
对表2梨渣总黄酮提取量的试验数据进行多元回归拟合后,由统计软件Design-Expert 8.0.6分析,建立二次多元回归方程:总黄酮提取量=5.17+0.10A+0.29B-0.21C+0.41D+0.14AB+0.072AC-0.26AD+0.39BC-0.095BD-0.57A2-0.36B2-0.41C2-0.24D2。
表3 Box-Behnken试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experimental results
从表3可以看出,建立的模型F值为7.83(p<0.001),说明该模型差异极显著,只有0.02%的可能是由于噪声而产生如此大的F值。失拟项p值为0.046 201小于0.05,说明差异显著。此外,D、A2对总黄酮提取量影响差异极显著,B、B2、C2对总黄酮提取量差异高度显著,C、BC、D2对总黄酮提取量差异显著,A、AB、AC、AD、BD、CD 项不显著(p>0.05),需将此 6项从回归模型中删除。回归模型方程最终为:总黄酮提取量=5.17+0.29B-0.21C+0.41D+0.39BC-0.57A2-0.36B2-0.41C2-0.24D2。
2.2.2 交互作用
各因素交互作用对梨渣总黄酮提取量影响的响应面图见图5。
图5 各因素交互作用对梨渣总黄酮提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction of various factors on total flavonoid extraction from pear residue
利用Design expert 8.0.6软件绘制出4个因素中任意两因素之间的交互作用响应面分析图。交互作用对于总黄酮提取量影响越显著意味着响应曲面的陡峭程度越大。由图5a可知,随着超声温度和超声时间的增加,总黄酮提取量呈现先上升后下降的趋势,两者交互作用曲面较陡,对总黄酮提取量影响显著。由图5b可知,随着超声温度和乙醇体积分数的增加,总黄酮提取量呈现先上升后下降的趋势,两者交互作用曲面较陡,对总黄酮提取量影响显著。由图5c可知,总黄酮提取量分别随着超声温度和液料比的增加呈现上升的趋势然后趋于平缓。由图5d可知,超声时间和乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响呈抛物线的趋势,即随着超声时间和乙醇体积分数的增加,总黄酮提取量呈先升高后下降的趋势。
2.2.3 验证试验结果
经优化后得到的最佳提取条件为超声温度48℃、超声时间43min、乙醇体积分数56%、液料比47∶1(mL/g)此时总黄酮理论提取量为5.38 mg/g。为验证最佳提取条件的准确性,设定超声温度48℃、超声时间43 min、乙醇体积分数56%、液料比47∶1(mL/g)进行试验,得到的总黄酮提取量为5.25 mg/g,与理论值接近,说明该工艺稳定可靠,具有一定价值。
2.3 抗氧化性研究
2.3.1 还原能力的测定
不同浓度黄酮溶液还原能力的测定见图6。
图6 不同浓度黄酮溶液还原能力的测定Fig.6 Determination of reduction capacity of sample solution with different concentrations
由图6可知,随着黄酮浓度的增加其吸光度也在不断增加,还原能力增强,当浓度增加至26 μg/mL,吸光度达到0.2,此后其吸光度基本趋于平衡。
2.3.2 DPPH自由基清除率的测定
不同浓度黄酮溶液对DPPH自由基清除率的测定见图7。
图7 不同浓度黄酮溶液对DPPH自由基清除率的测定Fig.7 Determination of DPPH removal rate of different concentration sample solution
由图 7 可知,当浓度在 5 μg/mL~40 μg/mL 范围内DPPH自由基清除能力随黄酮浓度的提高而增强,当浓度增加到35 μg/mL,清除率达到80%,此后其清除率基本趋于平衡。此试验表明黄酮对DPPH自由基有较高的清除率,抗氧化能力较强。
3 结论
梨渣中含有大量的黄酮类化合物,应用超声波辅助提取技术可实现其中的总黄酮的快速提取,本文通过超声辅助提取法提取梨渣中的黄酮,在单因素试验的基础上,利用响应曲面法对梨渣中黄酮提取工艺进行优化,超声温度48℃、超声时间43 min、乙醇体积分数56%、液料比47∶1(mL/g)时总黄酮提取量为5.25 mg/g。体外抗氧化活性研究表明,梨渣中黄酮对Fe3+还原能力较强,并对DPPH自由基有较高的清除率,是一种潜在的天然抗氧化活性物质,预期可以在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂方面有所应用。