响应面优化石榴皮安石榴苷提取工艺及其抗氧化活性研究
2020-12-01常占瑛刘桂花古丽巴合尔卡吾力开维赛尔阿娅阿卜力克木高晓黎
常占瑛,刘桂花,古丽巴合尔·卡吾力,开维赛尔阿娅·阿卜力克木,高晓黎,*
(1.新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830011;2.新疆维吾尔自治区药物研究所,新疆乌鲁木齐830004)
作为一种重要的食用水果,石榴(Punicagranatum L.)又名安石榴、山力叶、丹若等,落叶乔木或灌木;单叶,通常对生或簇生,无托叶。石榴皮收录于中国药典,具有润肠止泻、止血、驱虫的功效。石榴皮中的生物活性化合物非常多,如鞣质类(石榴皮中鞣质的含量高达25%~30%)[1]、类黄酮及原花青素类化合物,其中安石榴苷是石榴皮鞣质中重要的成分[2],含量在10%左右[3]。安石榴苷为棕黄色不定型粉末,极性强,易溶于水,可溶于乙醇等有机溶剂,能跟多种化学试剂发生显色反应,是逆没食子酸鞣质的一种,分子式为C48H28O30,相对分子质量为1 084.72,存在一对同分异构体,并且二者能够相互转换[4]。安石榴苷具有最强的抗氧化性[5-6]、抗癌细胞增殖[7]、抗肿瘤[5]以及降血脂作用[8]等。
目前石榴皮多酚的提取主要以回流提取[9]、浸提[10]、微波辅助提取[11-13]、超声波辅助提取[14-15]等方法为主,而以安石榴苷含量为指标,采用超声波辅助提取较少,本试验采用Box-behnken响应面设计利用超声波辅助提取安石榴苷工艺进行优化。并通过测定安石榴苷提取物清除DPPH自由基、羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O2-)以及ABTS+·4种自由基的能力,分析其抗氧化活性,以期为安石榴苷更广泛和深入的研究提供技术参考和理论依据,促进安石榴苷进一步开发应用。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
和田石榴皮(阴干):和田市麦迪森维吾尔医药公司,经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为石榴科石榴属石榴Punicagranatum L.的果皮。
安石榴苷对照品 (纯度大于98.82%,批号:MUST-18030501):成都曼斯特生物科技有限公司;三氟乙酸:成都市科隆化学品有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液:上海源叶生物科技有限公司;水杨酸:天津市北联精细化学品开发有限公司;30%H2O2溶液:天津市大茂化学试剂厂;DPPH试剂:梯希爱化成工业发展有限公司;硫酸铁、三氯化铁:天津市致远化学试剂有限公司;抗坏血酸、ABTS试剂:北京索莱宝科技有限公司;过硫酸钾:上海山浦化工有限公司。以上均为分析纯。
Agilent-1220高效液相色谱仪:美国安捷伦公司;FW135型高速万能粉碎机:北京市永光明医疗仪器有限公司;New Classic MF分析天平、LE104E/02电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ500DE型超声波清洗器:江苏省昆山市超声仪器;SHB-Ш循环水式真空泵:郑州长城科工贸有限公司;Milli-Q艾柯超纯水仪:美国密理博公司。
1.2 方法
1.2.1 安石榴苷的含量测定
1.2.1.1 色谱条件
色谱柱:Agilent SB-C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为0.1%三氟乙酸∶甲醇,梯度洗脱条件:0~10min,95% ∶5%;10 min~25 min,80% ∶20%;25 min~35 min,55% ∶45%;35 min~45 min,35% ∶65%;检测波长370 nm;流速 1 mL/min;进样量 10 μL;柱温 30 ℃[16]。
1.2.1.2 对照品溶液的制备
称取安石榴苷对照品6.06 mg,置10 mL容量瓶中,加入60%乙醇待全部溶解后定容,倍量稀释。用0.22 μm的微孔滤膜过滤,备用。
1.2.1.3 供试品溶液的制备
称取适量石榴皮粉末,加入一定量乙醇,超声处理,提取次数,过滤,合并滤液倒入250 mL容量瓶中,定容至刻度;倍量稀释。用0.22 μm的微孔滤膜过滤,备用。
1.2.1.4 线性关系考察
将对照品储备液倍量稀释,配制成不同浓度的水溶液,进样10 μL,以峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程:y=70 502x+348 994,R2=0.998 4,安石榴苷浓度在4.734 μg/mL~303.0 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。
1.2.2 单因素试验
在乙醇浓度分别为0%、20%、40%、60%、80%,料液比分别为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g/mL),提取时间 15、30、45、60 min,超声功率 80、120、160、200 W,提取次数1、2、3次的条件下,按照1.2.1.3的方法,进行乙醇浓度、料液比、提取时间、超声功率、提取次数5个因素对提取石榴皮安石榴苷含量的影响试验。
1.2.3 响应面法优化石榴皮安石榴苷超声提取工艺的试验设计
在单因素试验结果上,采用响应面法,对超声辅助提取石榴皮安石榴苷的影响因素进行研究和条件优化,做出响应面图,建模并分析各因素对响应值的影响[17-18]。
1.2.4 安石榴苷提取物体外抗氧化性试验
1.2.4.1 安石榴苷提取物对DPPH自由基清除作用
参考李珊珊等[19]的方法测定,以VC为对照,测定安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除作用。
1.2.4.2 安石榴苷提取物对·OH清除作用
参考张婉君等[20]的方法测定,以VC为对照,测定安石榴苷提取物对·OH的清除作用。
1.2.4.3 安石榴苷提取物对·O2-清除作用
参考廖国会等[21]的方法测定,以VC为对照,测定安石榴苷提取物对·O2-的清除作用。
1.2.4.4 安石榴苷提取物对ABTS+自由基清除作用
参考李卓瓦等[22]的方法测定,以VC为对照,测定石榴皮安石榴苷提取物对ABTS+自由基的清除作用。
2 结果与分析
2.1 高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)方法的建立
测定安石榴苷粗提样品和对照品的色谱图如图1所示。
图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram
2.2 单因素试验
2.2.1 乙醇浓度的考察
在料液比 1 ∶25(g/mL)、提取 30 min、提取 1 次、超声功率为200 W的条件下,乙醇浓度对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图2。
图2 乙醇浓度对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on the content of punicalagin in pomegranate peel
由图2可知,乙醇浓度对安石榴苷浓度大小有显著影响,随着乙醇浓度的增大,安石榴苷提取率先升高后降低。其中乙醇浓度为60%时安石榴苷含量最高,因此选择60%的乙醇作为提取溶剂进行后续试验。
2.2.2 料液比的考察
在60%的乙醇、提取30 min、提取1次、超声功率为200 W的条件下,料液比对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图3。
图3 料液比对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on the content of punicalagin in pomegranate peel
由图3可知,料液比对安石榴苷浓度大小有显著影响,在料液比为1∶25(g/mL)之前,随着溶剂的增加,安石榴苷含量逐渐增大,料液比为1∶30(g/mL)时与1∶25(g/mL)时差别不大,但考虑到试剂与环保等问题,选择料液比1∶25(g/mL)进行后续试验。
2.2.3 提取时间的考察
在60%的乙醇、料液比1∶25(g/mL)、提取1次、超声功率为200 W的条件下,提取时间对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图4。
由图4可知,提取时间对安石榴苷含量大小有显著影响,45 min以后安石榴苷的含量有所下降,可能是随着时间的延长,安石榴苷降解。因此选择提取时间为45 min进行后续试验。
图4 提取时间对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.4 Effects of extracting time on the content of punicalagin in pomegranate peel
2.2.4 超声功率的考察
在60%的乙醇、料液比 1∶25(g/mL)、提取 45 min、提取1次的条件下,超声功率对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图5。
图5 提取功率对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.5 Effects of extraction of power on the content of punicalagin in pomegranate peel
由图5可知,安石榴苷含量随着提取功率的增大而缓慢升高,其中200 W时安石榴苷含量相对较高,因此后续试验中选择超声功率200 W。
2.2.5 提取次数的考察
在60%的乙醇、料液比 1∶25(g/mL)、提取 45 min、超声功率为200 W的条件下,提取次数对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图6。
图6 提取次数对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.6 Effects of extraction times on the content of punicalagin in pomegranate peel
由图6可知,提取次数对安石榴苷浓度大小几乎没有影响,随着提取次数的增加,安石榴苷含量略有降低,可能是在过滤时有损耗,其中提取1次时安石榴苷含量相对最高,因此后续试验提取1次。
综上所述,以上因素都能影响石榴皮中安石榴苷提取浓度大小,结合单因素试验结果,在后续响应面试验中选取对安石榴苷提取浓度影响显著的3个因素,即乙醇浓度、提取时间和料液比,在最优范围分别设置3个水平进行响应面优化。
2.3 响应面试验
根据单因素试验结果,选取对安石榴苷提取浓度影响显著的3个因素,每个自变量选择3个水平,以-1、0、1进行编码,采用Box-behnken中心组合试验设计原理,以安石榴苷的浓度为响应值进行三因素三水平的试验设计,对提取工艺进行响应面优化。响应面试验设计因素与水平编码见表1,试验设计及结果见表2。
表1 响应曲面试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test design
表2 响应曲面试验方案及结果Table 2 Design and result for response surface experiment
应用Design-expert 8.0.6软件处理表2数据,经回归拟合得到安石榴苷超声波提取工艺条件的回归方程。
对回归方程进行回归分析,结果见表3所示。
表3 响应曲面回归方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the fitted regression model
由方差分析可以看出,模型P值<0.000 1,表明该模型方程高度显著。模型失拟项P值0.105 2>0.05,模型失拟项不显著,说明该回归模型与试验数据拟合程度较高,试验误差较小,可以用该模型分析石榴皮中安石榴苷含量提取工艺。且模型拟合度R2=0.989 7,大于90%,表明回归方程对安石榴苷浓度的预测值与实际值有比较好的相关性。在一次项的检验中,自变量A高度显著,自变量B极显著,自变量C不显著;各自变量的交互项均不显著;二次项的检验中,A2、B2达到高度显著,C2极显著。
响应面图直观地反映了任意2个因素对安石榴苷浓度的影响,具体交互影响结果见图7。
在响应面图中,响应面坡度越陡峭,则表明响应值越敏感。从响应面坡度来看,乙醇浓度与料液比和提取时间的曲线走势都比较陡峭,说明乙醇浓度对安石榴苷浓度大小的影响最显著,单个因素对安石榴苷提取率的影响大小顺序为乙醇浓度>提取时间>料液比,这与方差分析结果一致。响应面试验最优工艺条件为:乙醇浓度为 63.38%,1 ∶26.42(g/mL)的料液比提取40.39 min,预测安石榴苷含量为88.08 mg/g,实际操作中稍作调整,确定的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度 63%,料液比 1 ∶26(g/mL),超声提取时间 40 min。在最优工艺条件下提取3批样品,测定安石榴苷含量分别为 88.12、88.28、88.09 mg/g,与预测值相符,说明优化结果可信。
图7 响应曲面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour chromatograms
2.4 安石榴苷提取物体外抗氧化性试验
2.4.1 安石榴苷提取物对DPPH自由基清除作用
安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除作用,结果见图8。
图8 安石榴苷提取物及VC对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect on DPPH free radical of punicalagin extract and VC
DPPH是一种较为稳定的自由基,广泛应用于抗氧化成分的抗氧化活性评价[23]。由图8可以看出,VC及安石榴苷提取物均对DPPH自由基有一定的清除作用,而且对DPPH自由基的清除能力均与浓度剂量有关系,安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除能力略高于VC。DPPH自由基清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为:y=117.156 3x+38.177 7(R2=0.992 3),y=100.698 1x+36.739 5(R2=0.991 8),由此回归方程得到对应的DPPH自由基清除率50%时,所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为131.7 μg/mL和 101.0 μg/mL。
2.4.2 安石榴苷提取物对·OH清除作用
安石榴苷提取物对·OH的清除作用,结果见图9。
图9 安石榴苷提取物及VC对·OH的清除作用Fig.9 Scavenging effect on·OH of punicalagin extract and VC
由图9可以看出,对照品VC与安石榴苷提取物均对·OH有一定的清除作用,而且对·OH的清除能力均与浓度有剂量关系,0.2 mg/mL浓度以上,安石榴苷提取物清除率高于VC。·OH清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为:y=185.1587x+7.9876(R2=0.9964),y=59.125 5x+24.380 5(R2=0.997 4),由此回归方程得到对应的·OH清除率50%时,所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为433.4 μg/mL和227.0 μg/mL。
2.4.3 安石榴苷提取物对·O2-清除作用
安石榴苷提取物对·O2-的清除作用,结果见图10。
由图10可以看出,对照品VC及安石榴苷提取物均对超氧阴离子自由基有一定的清除作用,而且对超氧阴离子自由基的清除能力均与浓度有剂量关系,其中安石榴苷提取物对超氧阴离子自由基的清除率略低于VC。超氧阴离子自由基清除率对安石榴苷提取物,VC浓度的回归方程分别为:y=150.200 1x-1.312 4(R2=0.991 6),y=148.657 3x+8.279 0(R2=0.993 3),由此回归方程得到对应的超氧阴离子自由基清除率50%时,所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为280.8 μg/mL 和 341.6 μg/mL。
图10 安石榴苷提取物及VC对·O2-的清除作用Fig.10 Scavenging effect on·O2-of punicalagin extract and VC
2.4.4 安石榴苷提取物对ABTS+自由基清除作用
安石榴苷提取物对ABTS+自由基的清除作用,结果见图11。
图11 安石榴苷提取物及VC对ABTS+自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on ABTS+free radical of punicalagin extract and VC
由图11可以看出,对照品VC与安石榴苷提取物均对ABTS+自由基有一定的清除作用,而且对ABTS+自由基的清除能力均与浓度有剂量关系。ABTS+自由基清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为:y=1.794 8x-14.267 7(R2=0.997 3),y=1.402 2x+1.181 1(R2=0.997 2),由此回归方程得到对应的超氧阴离子自由基清除率50%时,所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为34.82 μg/mL和35.81 μg/mL。
3 结论
对石榴皮安石榴苷提取工艺进行优化,得到优化工艺条件为:乙醇浓度 63%,料液比 1∶26(g/mL),超声提取时间40 min,超声功率200 W,提取1次,在此条件下,安石榴苷含量为(88.16±0.10)mg/g。
安石榴苷做为石榴皮多酚中主要有效成份,大量研究表明石榴多酚具有抗氧化活性[24-25]。在本次试验中,安石榴苷提取物对于DPPH自由基、OH自由基清除率IC50略低于VC,而其对ABTS+自由基和超氧阴离子自由基的IC50略高于VC,表明安石榴苷提取物具有较好的清除DPPH自由基和OH自由基的能力。