抑郁症肝郁脾虚证与SIRT1/PGC-1α通路的关联性研究

李阳， 郭蓉娟， 于姚， 袁清洁， 郭建友

（1. 首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3. 北京中医药大学，北京 100029；4. 清华大学玉泉医院，北京 100040；5. 中国科学院心理研究所，北京 100101）

抑郁症以其高患病率、高复发率、高致残率和高自杀倾向的特点，已成为严重影响人类健康的世界性公共卫生问题。近年来，很多学者对抑郁症中医证候进行大样本的流行病学研究，均得出类似的结论，证明了肝郁脾虚证是抑郁症最常见的证型[1-2]。中医脾为 “后天之本” 的角色与线粒体作为 “人体生命活动枢纽” 的认识高度吻合。有研究[3]发现，脾虚模型大鼠可出现心肌、肝、胃黏膜、骨骼肌和小肠细胞中线粒体含量减少，且形状结构也存在异常。可见脾虚与线粒体能量代谢障碍密切相关，而线粒体能量代谢异常为抑郁症肝郁脾虚的病机研究提供了新视角。SIRT1/PGC-1α 通路调控的线粒体生物合成是线粒体能量代谢的关键环节，对维持线粒体氧化磷酸化合成三磷酸腺苷（ATP）的能力具有至关重要的作用。探究抑郁症肝郁脾虚证是否会出现SIRT1/PGC-1α通路的异常，对该证型的诊断研究和药物治疗靶点的研究均具有重要的意义。

1 对象与方法

1. 1研究对象选取2018年1月至2018年6月期间志愿参与本研究的合格受试者30 例，包括健康人（平和质）10 例，肝气郁结型抑郁症患者10 例，肝郁脾虚型抑郁症患者10 例。在研究对象的选取过程中，凡符合纳入标准的志愿者均对其详细解释说明研究方法并经其知情同意后方成为本研究的受试者。

1. 2诊断标准

1. 2. 1 抑郁症诊断标准 参照《中国精神障碍分类和诊断标准》（CCMD-3）[4]中抑郁症的诊断标准；汉密尔顿抑郁量表24 项（HAMD-24）评分≥8 分且＜35分的轻、中度抑郁症患者。

1. 2. 2 中医证候诊断标准 依据国家技术监督局1997 年颁布的《中医临床诊疗术语证候部分（GB/T16751.2-1997）》[5]中有关肝气郁结证和肝郁脾虚证的诊断，并参照郭蓉娟等[6]发表的《抑郁症中医证候要素辨证量表研究》 一文中抑郁症中医证候要素辨证量表的证候要素进行相关证候的诊断。

1. 3纳入标准

1. 3. 1 健康人组纳入标准 ①HAMD-24 评分＜8 分；②18 岁≤年龄≤65 岁；③中医体质量表判定为平和质；④自愿参加本研究并签署知情同意书的受试者。

1. 3. 2 肝气郁结型抑郁症组纳入标准 ①符合上述抑郁症的诊断标准； ②符合肝气郁结证的证候诊断标准；③20 分≤HAMD-24 评分≤35 分；④18岁≤年龄≤65岁；⑤自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1. 3. 3 肝郁脾虚型抑郁症组纳入标准 ①符合上述抑郁症的诊断标准；②符合肝郁脾虚证的证候诊断标准；③20 分≤HAMD-24 评分≤35 分；④18岁≤年龄≤65岁；⑤自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1. 4排除标准①属于双相情感障碍和精神分裂症的患者；②合并有严重的心脏病、肾病、神经病、脑血管病、肝病、出血性疾病、代谢性疾病以及肺功能障碍的患者；③存在线粒体疾病的患者；④存在意识障碍的患者。

1. 5研究方法纳入研究的健康人和肝气郁结型抑郁症、肝郁脾虚型抑郁症患者，于入组当天使用6 mL含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集静脉血5 mL，静置1 h；在3 000 r/min、25 ℃条件下离心10 min 后，分离血清，剩余液通过聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度离心法分离提纯外周血单个核细胞。以Western Blot 法检测沉默信息调节因子1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1（NRF-1）、核呼吸因子2（NRF-2）、线粒体转录因子A（TFAM） 蛋白表达含量。

1. 6统计方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据的统计分析。数据为连续性计量资料且符合正态分布者，以均数± 标准差（x ± s）表示，运用单因素方差分析。数据不符合正态分布者，采用中位数和四分位数间距[M（P25，P75）]描述，并运用非参数检验进行比较分析。对于计数资料，用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 3组受试者的基本资料比较表1 结果显示：3组受试者的年龄经非参数检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 组受试者的性别经χ2检验，差异也无统计学意义（P＞0.05）。

表1 3组受试者的基本资料比较Table 1 Comparison of the baseline data of the three groups

2. 2 3组受试者的Western Blot检测结果图1 和图2结果显示：与健康人组相比，肝气郁结型抑郁症组患者的外周血SIRT1 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），肝郁脾虚型抑郁症组患者的外周血SIRT1、PGC-1α、TFAM蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。

图1 3组受试者的Western Blot结果Figure 1 Comparison of Western Blot results in the three groups

图2 3组受试者的Western Blot条带图Figure 2 Comparison of Western Blot strap of the three groups

3 讨论

10 号染色体上的沉默信息调节因子1（silent information regulator 1， SIRT1）是一种去乙酰化酶，它广泛分布在哺乳动物的成熟组织，是典型的组蛋白脱乙酞酶（HDACs），也是目前sirtuins 家族研究最多的一个蛋白[7]。 SIRT1 可使FOXO、PGC-1α、PPAR-γ 和NF-κB 等核转录因子去乙酰化，在调节糖异生、糖酵解和脂肪β氧化，改善胰岛素敏感性、线粒体损伤和炎症等方面具有重要作用[8]。随着研究的深入，人们发现SIRT1 通过脱乙酰化作用参与大脑正常的生理功能并且与神经精神疾病密切相关。SIRT1基因敲除或变异的小鼠产生了海马基因表达变化、突触可塑性缺失和树突分支减少等表现[9]。Naoko A 等[10]的临床研究发现，重度抑郁症患者血细胞中SIRT1 mRNA水平是显著下降的； Iacono L L 等[11]也发现小鼠出现的抑郁样行为与大脑中SIRT1水平下降相关；王玥等[12]在研究中发现，应激抑郁大鼠SIRT1 mRNA表达量显著低于对照组，提示抑郁可引起SIRT1的表达异常。SIRT1的表达降低，影响了其参与机体系统代谢，也减少了其保护作用。由此可见，众多的研究提示SIRT1与抑郁症密切相关，但是SIRT1功能缺失是如何诱发抑郁症的，其中的病理机制并不明确。PGC-1α 是SIRT1 下游的一个主要靶基因，广泛参与线粒体生物合成等多条代谢途径[13]，被视为控制线粒体功能及能量的动态平衡的效应器[14]。当细胞能量储存减少，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平升高，则会激活SIRT1，进而去乙酰化PGC-1α 而促进ATP 的产生[15]。PGC-1α 特异性的表达于能量需求高并富含线粒体的组织，如骨骼肌、脂肪、心、肝及肾脏等，在寒冷、禁食、运动等能量限制状态下表达增加，不仅可以促进线粒体的生物合成，且能与PPARγ 相互作用，调节适应性产热[16]。且PGC-1α是线粒体生物源与呼吸的有效刺激物，是大多数细胞线粒体电子传递链中活性氧的主要生产者，可以防止由神经细胞与氧化应激因子引起的死亡[17]。线粒体在促进机体适应性产热、呼吸系统表达的同时需要依赖核线粒体基因。Guqneja S 等[18]发现了线粒体基因编码的2 个重要因子，即NRF-1 和NRF-2。NRF-1 作用于线粒体血红素合成相关基因和线粒体蛋白转运基因，对于核基因和线粒体基因的表达具有辅助调控作用。NRF-2 异源二聚体可与许多核编码线粒体蛋白基因的启动子序列结合，有些基因还包含NRF-1 的结合位点。NRF-1 和NRF-2 在呼吸亚基的表达和线粒体转录因子表达方面发挥着重要作用。Puigserver P 等[19]证明，PGC-1α是NRF系统的重要效应物，它可上调NRF-1 和NRF-2。线粒体转录因子A（TFAM）是由核基因编码的一种小分子多肽，能激活及调节线粒体转录及复制，并在氧化应激中起着重要作用[20]。它通过包裹细胞内线粒体DNA（mtDNA）形成类似组蛋白的核样结构[21]，维护其完整和稳定，使其免受氧化应激（OS）损伤[22]；同时，通过促进mtDNA 的复制来调节其拷贝数，这是TFAM 保护线粒体功能的基础[23]。

本研究发现，与健康人群相比，肝气郁结型抑郁症组患者外周血SIRT1 含量明显升高（P＜0.05），而PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM 含量存在上升趋势（P＞0.05），说明肝气郁结型抑郁症患者SIRT1/PGC-1α 信号通路的活性可能被上调。因为肝气郁结多处于抑郁症发展过程的早期，此时机体需要更多的能量以抵抗应激反应，所以这可能是线粒体的合成和呼吸作用被加强的原因。从中医角度来讲，肝气郁结证处于气机郁滞的状态，多由肝主疏泄的功能异常导致，此时正气并未亏虚，而肝为刚脏，具有刚强躁急的生理特性，故肝气郁结时则表现出情绪焦虑抑郁、胸胁胀满不舒等一系列机体高动力表现，也同样印证了为何线粒体的合成和呼吸作用被加强。反观肝郁脾虚型抑郁症患者， 外周血SIRT1、 PGC- 1α、TFAM 蛋白表达含量均明显降低（P＜0.05），而NRF-1、NRF-2 含量存在下降趋势（P＞0.05），说明肝郁脾虚型抑郁症患者SIRT1/PGC-1α信号通路的活性可能被抑制。因为肝郁脾虚多处于抑郁症发展过程的中后期，此时机体在经过长时间的外界事件刺激后导致神经、内分泌、免疫等多个系统的失调，形成机体从情绪异常到机体机能紊乱的过渡，在此过程中产生的氧化应激或炎症反应等可通过破坏线粒体内膜、损伤mtDNA、下调PGC- 1α 等形式损伤机体各部位的线粒体功能[24-28]，故机体出现情绪低落、兴趣缺乏、极度疲乏、思维迟缓、食欲减退、腹泻等中枢及外周的多系统低动力症状，这可能是线粒体的合成和呼吸作用被减弱的原因及结果。从中医角度来讲，肝失疏泄日久导致肝失条达或气郁日久化火，均可进一步导致肝气（火）横逆犯脾，而脾主运化，脾气虚弱则不能运化水谷，故出现食欲减退；脾虚易被湿困，故出现便溏不爽；脾主升清，将水谷精微上输于心、脑等以荣养之，脾虚不能升清，故出现情绪低落、兴趣缺乏等大脑能量低下症状；脾主肌肉，气虚则致肌肉疲乏无力，故肝郁脾虚时表现出机体功能全面低下的状态，与线粒体的合成和呼吸作用被抑制的多系统低动力症状表现趋于一致。

总之，肝郁脾虚型抑郁症患者存在线粒体能量代谢及生物合成功能的障碍，这可能是其多系统低动力症状的病理机制之一，SIRT1/PGC-1α 通路介导的线粒体能量代谢及生物合成异常也可能是抑郁症肝郁脾虚证的生物学实质之一，这为未来进一步探究抑郁症肝郁脾虚证的生物学诊断及药物作用靶点提供了重要借鉴。