脑胶质瘤中UBE2S和CCNB1的表达及临床意义

尹璋星， 赵文旭， 廖黎庆， 刘 瑛， 谢 涛， 余 华

(湖北省潜江市中心医院神经外科， 湖北 潜江 433100)

脑胶质瘤是脑部最严重和最常见的原发性肿瘤，具有侵袭性强，治疗难度大、术后易复发、死亡率高的特点[1]。细胞周期蛋白B1(cyclin B1，CCNB1)能够调节成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)，与MPF的催化亚单位细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)相互结合，在细胞G2/M期交接处驱动细胞周期时相转换，启动细胞有丝分裂[2]。研究表明CCNB1在肿瘤细胞和组织中高表达，使细胞在DNA已受损的情况下MPF仍可被激活，导致细胞持续进行有丝分裂，最终形成肿瘤[3]。泛素结合酶E2S(ubiquitin-conjugating enzyme 2S，UBE2S)相对分子质量为24000，属于泛素-蛋白酶系统中的主要成员，与细胞周期调控、凋亡、免疫应答、DNA修复等密切相关[4]。近几年，CCNB1和UBE2S在其它肿瘤组织表达情况逐渐成为研究热点，而在脑胶质瘤组织中表达水平研究较少。本研究拟测定脑胶质瘤组织中CCNB1和UBE2S表达水平，探讨二者与脑胶质瘤患者临床病理特征及预后的关系，以期为脑胶质瘤的预后提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2015年1月至2019年4月本院手术切除的脑胶质瘤组织标本106例，其中男性62例，女性44例，年龄16岁～66岁，平均年龄(41.67±5.64)岁。按照WHO中枢神经系统肿瘤的分类标准[5]，进行病理组织分级：Ⅰ～Ⅱ级68例，归为低级别脑胶质瘤组；Ⅲ～Ⅳ级38例，归为高级别脑胶质瘤组。另选取我院收治的因脑出血或外伤进行颅内减压的患者脑组织标本114例作为对照组，其中男性65例，女性49例，年龄15岁～66岁，平均年龄(39.61±4.28)岁。纳入标准：①患者经病理诊断为脑胶质瘤；②患者术前未接受放疗或化疗；③所有受试者及家属对本研究知情，并签订知情同意书。排除标准：①患者病例资料不全，无法进行随访；②患者有心脏病、肝病、高血压等疾病。本研究经潜江市中心医院伦理委员会审核批准。

1.2主要试剂:蛋白裂解液购自上海贝博生物科技公司，货号：BB-3201；BCA蛋白定量试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号T-17493；兔抗人CCNB1、兔抗人UBE2S、兔抗人β-actin、羊抗兔IgG二抗均购自美国Abcam公司，货号：ab1370、ab13702、ab13714、ab0016。

1.3免疫印记(Western blot，WB)法测定脑胶质瘤组织和正常脑组织中CCNB1、UBE2S表达水平:首先将所取组织(0.5g)放置于蛋白裂解液中进行裂解，收集蛋白质使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶中封闭膜1h，加入兔抗人CCNB1(1:1000)、兔抗人UBE2S(1:1000)、兔抗人β-actin(1:1000)一起孵育4℃过夜，然后加入羊抗兔IgG二抗(1:5000)室温孵育2h，加入蛋白显色液，采用增强型化学发光检测系统检测蛋白表达情况，以β-actin蛋白作为内参，来测定组织中CCNB1和UBE2S蛋白含量。

1.4随访:所有脑胶质瘤患者术后均接受常规随访，随访时间6～48个月，本次随访截止日期2019年10月，死亡患者以死亡日期作为随访截止时间，本次随访的中位时间25.89个月。观察并记录脑胶质瘤患者在随访期间复发和生存情况。

2 结 果

2.1三组间CCNB1和UBE2S表达水平比较:对照组、低级别脑胶质瘤组和高级别脑胶质瘤组之间CCNB1和UBE2S表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中高级别脑胶质瘤组CCNB1和UBE2S表达水平明显高于低级别脑胶质瘤组和对照组(P<0.05)，低级别脑胶质瘤组CCNB1和UBE2S表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 UBE2S和CCNB1在各类脑胶质组织上表达水平

2.2CCNB1、UBE2S表达水平与脑胶质瘤患者临床病理指标的关系:将脑胶质瘤患者进行分组，CCNB1和UBE2S表达水平高于各组平均数的患者记为高表达，等于或者低于表达水平均数的患者记为低表达。CCNB1和UBE2S在脑胶质瘤组织中表达水平与患者的年龄、性别、病理学类型无关(P>0.05)，与肿瘤的组织分化程度、瘤周水肿、浸润程度有关(P<0.05)，见表2。

表2 CCNB1 UBE2S表达水平与脑胶质瘤患者临床病理指标的关系

2.3脑胶质瘤组织中CCNB1和UBE2S表达水平的相关性:Pearson法分析结果表明，脑胶质瘤组织中CCNB1和UBE2S表达水平呈正相关，差异有统计学意义(r=0.460，P<0.05)，见图1。

2.4CCNB1和UBE2S表达水平与脑胶质瘤患者术后生存时间的关系:CCNB1高表达脑胶质瘤患者术后中位生存时间为32.03个月，显著短于CCNB1低表达患者术后中位生存时间44.15个月(P<0.05)，见图2。UBE2S高表达脑胶质瘤患者术后中位生存时间为31.50个月，显著短于UBE2S低表达患者46.68个月(P<0.05)，见图3。

2.5影响脑胶质瘤患者预后的危险因素:单因素分析表明，组织低分化、瘤周高度水肿、有浸润、CCNB1高表达、UBE2S高表达均是影响脑胶质瘤患者不良预后的危险因素(P<0.05)。多因素分析表明，组织低分化、CCNB1高表达、UBE2S高表达是影响脑胶质瘤患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 Cox回归分析脑胶质瘤患者预后的危险因素

图1 脑胶质瘤组织中CCNB1和UBE2S表达水平的相关性

图2 CCNB1表达水平与脑胶质瘤患者术后生存时间关系

图3 UBE2S表达水平与脑胶质瘤患者术后生存时间关系

3 讨 论

过去认为脑胶质瘤的发病原因与颅脑外伤、内分泌失调、病毒感染、生化因素等密切相关，随着对脑胶质瘤更深入研究，发现癌症发生发展与分子水平改变有关，在致癌因素刺激下，致癌基因异常表达或抑癌基因表达沉默，使得细胞调控机制紊乱，细胞增殖失控，导致肿瘤的发生发展[6,7]。

近年为直观了解肿瘤的发生发展过程，探究肿瘤细胞周期调控因子成为当前研究热点，CCNB1和UBE2S在肿瘤细胞增殖、调控中发挥着重要作用[8]。Fei等[9]研究表明CCNB1在皮肤恶性肿瘤患者外周血中高表达，且肿瘤恶性程度越高，CCNB1表达水平也越高，因此CCNB1可作为反应皮肤恶性肿瘤恶性程度参考指标。王玲等[10]研究表明CCNB1在乳房外Paget病中高表达，可能参与细胞周期调控，致使细胞异常增殖，最终发展成肿瘤。Ding等[11]研究表明CCNB1在胃癌组织中高表达，并与慢性胃病、胃癌前病变、胃癌的发生发展有关，提示其在胃癌的演变过程中发挥着重要作用。胡力等[12]研究表明UBE2S在恶性胶质瘤中高表达，敲低UBE2S后，可以降低非同源末端连接复合物DNA修复效率，从而加强胶质瘤细胞对放、化疗的敏感性。曹进等[13]发现UBE2S在胆囊癌组织中表达水平显著高于胆囊癌前病变和良性病变组织，UBE2S高表达胆囊癌患者生存期较短，是胆囊癌患者不良预后的独立因素。

本研究采用免疫印记法测定脑胶质瘤组织和正常脑组织中CCNB1、UBE2S表达水平，结果表明低级别脑胶质瘤组和高级别脑胶质瘤组CCNB1和UBE2S表达水平显著高于对照组，且高级别脑胶质瘤组显著高于低级别脑胶质瘤组，提示CCNB1和UBE2S表达水平与脑胶质瘤有密切关系，随病情严重程度升高。另外，本研究发现脑胶质瘤患者CCNB1和UBE2S表达水平与年龄、性别、病理学类型无关，与肿瘤组织分化程度、瘤周水肿、浸润程度有关，提示CCNB1和UBE2S可能参与脑胶质瘤发生发展过程。Pearson分析表明CCNB1和UBE2S表达水平呈正相关，进一步分析发现，CCNB1、UBE2S高表达脑胶质瘤患者术后中位生存时间分别显著短于低表达患者，提示CCNB1、UBE2S高表达水平者预后更差。采用COX多因素分析发现，组织低分化、CCNB1高表达、UBE2S高表达是影响脑胶质瘤患者不良预后的独立危险因素，提示CCNB1和UBE2S可能作为判断脑胶质瘤预后的临床指标，对此临床及时检测CCNB1和UBE2S水平可及时预测预后，也为临床治疗提供一定参考。