环磷酰胺对百草枯中毒家兔肺过氧化损伤的干预作用

蒋昌华, 简万均, 符宜龙, 唐中建, 舒艾娅

(重庆市涪陵中心医院重症医学科, 重庆 408000)

百草枯是一种联砒啶类高效除草剂，因其能在土壤中迅速钝化，对环境污染较小，且除草效果好，在全球范围内被广泛使用[1]。百草枯的毒性极高，无特效解毒药，可经消化道、呼吸道以及皮肤黏膜吸收，中毒后死亡率可高达60%～70%[2]。百草枯进入机体后可随血液分布至各组织器官，引起全身多脏器功能损害。肺是百草枯的主要靶器官，肺泡上皮细胞存在百草枯特殊性转运体，导致百草枯在肺组织内大量聚集，继而引起肺泡充血、水肿，最终引发不可逆的肺纤维化[3]。临床上对于百草枯中毒尚无特异性解毒剂，主要采取对症治疗和给予激素、免疫抑制剂等药物为主，但治疗效果并不理想，病死率依然居高不下[4]。环磷酰胺属于免疫调节类制品，能够增强机体免疫力，缓解肺部炎症反应程度[5]。有研究[6]表明，环磷酰胺联合糖皮质激素冲击治疗能够有效降低降低百草枯中毒患者的死亡率，但其作用机制尚不清楚。本文通过检测百草枯中毒家兔血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)表达情况，探讨环磷酰胺干预对血清细胞因子的影响，为环磷酰胺治疗百草枯中毒的作用机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物:选取清洁级健康家兔40只，雌雄不限，月龄3～6个月，体重2.5～3.0kg。实验动物购于重庆医科大学动物实验中心，动物合格证号：SYXK(渝)2012-0001；家兔购入后单笼饲养，保持饲养环境清洁开放，饮水自由、定时给予饲料，观察动物情况，1周后将饮食、排泄以及精神状况正常家兔纳入研究备用。

1.2实验试剂与药品:20%百草枯溶液购于北京先正达公司，生理盐水(H20054037)购于安徽双鹤药业，环磷酰胺(H14023686，0.2g/支)购于山西普德药业，甲强龙(H20123319，0.5g/支)购于天津金耀药业，TGF-β1检测试剂盒购于深圳丹纳赫公司，MDA、SOD检测试剂盒购于南京建成生物研究所，XS2型酶标仪购自铂金埃尔默仪器公司。

1.3动物造模及干预:将40只家兔随机分为对照组、模型组、甲强龙组、环磷酰胺+甲强龙组，每组10只。模型组、甲强龙组、环磷酰胺+甲强龙组根据动物体质量按照50mg/kg剂量进行百草枯溶液灌胃染毒，对照组则给予相同剂量生理盐水灌胃。动物染毒后24h开始干预治疗，其中对照组和模型组动物按照3mL/kg剂量腹腔注射生理盐水，甲强龙组按照0.4mg/kg剂量腹腔注射甲强龙，环磷酰胺+甲强龙组同时给予0.4mg/kg甲强龙和60mg/kg环磷酰胺；每日上午给药，连续7d。

1.4标本采集与检测:分别在干预治疗1d、3d、5d、7d后经耳缘静脉采集血液标本3mL，静置10min，3000r/min离心15min，吸取血清-80℃保存待检。按照试剂盒说明书采用酶联免疫法检测血清TGF-β1水平，硫代巴比妥酸法测定血MDA水平，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。

2 结 果

2.1实验动物情况:对照组动物在研究过程中活动自如，食水摄入正常，体质量趋于稳定。模型组动物染毒后1～3h后即逐步显现出中毒症状，初表现为反应迟钝、精神萎靡、食水摄入量减少；染毒1d后食欲持续降低、口鼻可见淡红色分泌物；染毒后3d后出现呼吸急促、流涎、腹泻等症状。甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组治疗过程中毒表现与模型组大致相同，如呼吸急促、食水摄入量减少、精神萎靡等，但甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组症状较轻、持续时间较短，治疗后第5d后症状开始缓解，精神状况有所改善，食欲逐渐恢复，呼吸也逐渐平稳。

2.2各组兔不同时点血清TGF-β1水平比较:染毒后1d，模型组、甲强龙组、环磷酰胺+甲强龙组血清TGF-β1水平均高于对照组(P<0.05)，而模型组、甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清TGF-β1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d时，模型组血清中TGF-β1水平均显著高于对照组(P<0.05)；甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清中TGF-β1水平明显低于模型组(P<0.05)，但均显著高于对照组(P<0.05)；环磷酰胺+甲强龙组血清中TGF-β1水平均低于甲强龙组(P<0.05)，见表1。

表1 各组动物染毒后不同时点血清TGF-β1水平比较

2.3各组兔在不同时点血清MDA水平比较:染毒后1d，模型组、甲强龙组、环磷酰胺+甲强龙组血清MDA水平均高于对照组(P<0.05)，而模型组、甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清MDA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d时，模型组血清MDA水平均显著高于对照组(P<0.05)；甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清MDA水平均低于模型组(P<0.05)，但又明显高于对照组(P<0.05)；环磷酰胺+甲强龙组血清MDA水平均显著低于甲强龙组(P<0.05),见表2。

2.4各组兔在不同时点血清MDA、SOD水平比较:染毒后1d，模型组、甲强龙组、环磷酰胺+甲强龙组血清SOD水平均低于对照组(P<0.05)，而模型组、甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清SOD水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。染毒后3d、5d、7d时，模型组血清SOD水平均明显低于对照组(P<0.05)；甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组血清SOD水平高于模型组，但显著低于对照组(P<0.05)；环磷酰胺+甲强龙组血清SOD水平均明显高于甲强龙组(P<0.05)，见表3。

表2 各组动物染毒后不同时点血清MDA水平比较

表3 各组动物染毒后不同时点血清SOD水平比较

3 讨 论

百草枯是一种触杀型砒啶类除草剂，能够阻断植物细胞电子转运系统，导致细胞内氧自由基大量聚集，从而对接触的绿色植物起杀灭作用[7]。有研究[8]发现，百草枯与内源性聚胺类分子的结构类似，肺泡上皮细胞存在聚胺类物质的转运体，百草枯会在肺部逆浓度差吸收，肺组织中百草枯的蓄积浓度可达到血浆的80～90倍。一项关于百草枯中毒患者随访研究[9]发现，百草枯中毒初期即使存在轻度肺损伤，也会造成肺部严重的弥散性功能障碍，甚至出现不可逆的肺纤维化。

TGF-β1是判断组织纤维化程度的重要指标，主要由肺泡巨噬细胞和肺间质细胞释放，其过表达会导致成纤维细胞大量聚集，促进胶原蛋白的沉积，加快组织纤维化进程[10]。MDA是膜脂过氧化反应产物，能间接反映膜系统过氧化程度；SOD是生命体中重要活性物质，能消除新陈代谢过程中产生的氧自由基，从而发挥抗氧化作用[11]。本研究显示，模型组动物染毒后各时点血清TGF-β1和MDA水平均显著升高，且SOD水平则明显降低；且随着时间的推移，血清TGF-β1和MDA呈升高趋势，血清SOD水平则呈明显降低趋势。提示氧化应激参与百草枯中毒的肺损伤过程，随着中毒时间的推移，体内超氧自由基集聚，导致肺过氧化损伤逐渐加重。

甲强龙是一种人工合成的糖皮质激素，具有较强抗炎和免疫抑制作用，能够提高机体对有害刺激的应激能力，从而抑制纤维细胞活性，减轻肺纤维化进程[12]。环磷酰胺是一种免疫调节药物，能够缓解炎症反应，减少白细胞的表达，减轻肺部炎症损伤。本研究结果显示，甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组家兔在染毒后治疗的第1d血清TGF-β1、MDA、SOD水平与模型组无明显差异，可能是由于疗程较短，尚不能有效扭转百草枯所造成的毒性损伤。随着时间的推移，甲强龙组和环磷酰胺+甲强龙组家兔血清TGF-β1、MDA水平逐步降低，血清SOD水平逐渐升高，说明在连续使用环磷酰胺和甲强龙治疗后，体内氧化-抗氧化平衡逐渐恢复，肺组织损伤也得到改善。环磷酰胺+甲强龙组家兔在治疗第3d、5d、7d血清TGF-β1、MDA及SOD水平改善程度优于甲强龙组，提示在甲强龙治疗基础上加用环磷酰胺能降低百草枯中毒导致的氧化反应程度，减轻肺过氧化损伤，扭转肺纤维化病情。

综上所述，环磷酰胺能有效降低TGF-β1、MDA的表达和提高血清SOD浓度，促进机体氧化-抗氧化平衡，改善百草枯中毒引起的肺过氧化损伤。