2D-HPLC-QTOF法对注射用盐酸表柔比星中二聚体的鉴定

邵伍军 和燕玲,* 金美春 陈延安 陈逢灶

(1 浙江海正药业股份有限公司，台州 318000；2 台州学院，台州 318000)

盐酸表柔比星属于广谱抗肿瘤抗生素，是乳腺恶性肿瘤化疗的一线用药，收载于多个国家药典[1-4]。表柔比星中的已知杂质有多柔比星、双氢柔红霉素、多柔比星酮、柔红霉素(起始原料)、4'-盐酸表柔红霉素(中间体)、柔红霉素酮和三氟乙酰柔红霉素(中间体)等[5-6]，目前对注射用盐酸表柔比星中杂质检测主要采用HPLC法。注射用盐酸表柔比星在长期稳定性留样检测中会出现一个未知峰，由于注射用盐酸表柔比星现有HPLC检测方法流动相中含有磷酸和十二烷基硫酸钠缓冲盐，不适合LC-MS直接分析，且由于离子对试剂的影响及该杂质不稳定，对此杂质峰很难进行制备定性测定。本文采用新建的在线二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对该磷酸及十二烷基硫酸钠缓冲盐系统中注射用盐酸表柔比星的未知杂质峰进行了定性分析，鉴定该未知杂质为盐酸表柔比星二聚体。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Agilent 1260型HPLC，Agilent 6540型LCQTOF。乙腈、甲醇均为市售色谱纯；甲酸为市售质谱纯；其余试剂均为分析纯。水为Milli-Q超纯水。

注射用盐酸表柔比星(浙江海正药业公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 一维色谱条件

色谱柱：Venusil ASB C18(250mm×4.6mm,5μm)，Agela ；波长：254nm；流速：2.0mL/min；柱温：35℃；流动相：乙腈-水-甲醇-85%磷酸溶液(290:540:170:1,V/V/V/V)并含0.2%十二烷基硫酸钠的混合溶液。

1.2.2 二维色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18, 2.1mm×50mm,1.8um；波长：254nm；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液(70:30)。

1.2.3 质谱条件

ESI源；正离子模式；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8L/min；雾化气压力：35psig；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；采集模式：MS及Targeted MS/MS。

1.2.4 操作步骤

取注射用盐酸表柔比星适量，加一维液相的流动相制成约含100μg/mL盐酸表柔比星的溶液，取50μL注入一维液相色谱仪，通过一维紫外检测色谱图确定各杂质的出峰位置，分别对主峰和未知杂质进行中心切割，通过在液相色谱方法中设置阀切换时间，将杂质收集于定量环中，再通过阀切换将杂质从定量环中反冲至二维色谱柱上分离并脱盐，最后进入质谱进行分析。四极杆-飞行时间质谱仪采用Targeted MS/MS的采集模式，同时得到一级质谱和二级质谱。使用软件通过精确相对分子质量和同位素分布进行元素组成分析，确定分子式，结合表柔比星二级质谱碎片和该未知杂质二级质谱碎片推导该杂质可能的结构。

2 结果与讨论

2.1 注射用盐酸表柔比星主峰二维在线脱盐结构确认

取样品溶液，按“1.2”项下实验条件及操作步骤测定，一维液相中主峰保留时间在10.2min，切换到二维液相中后，紫外中主峰保留时间17.2min，总离子流中保留时间17.3min，质谱信号[M+H]+质荷比为544.1814，盐酸表柔比星主峰一维、二位液相图及总离子流色谱图见图1。表柔比星二级质谱图及碎片离子归属见图2。

2.2 注射用盐酸表柔比星样品中未知杂质峰结构推测

图1 注射用盐酸表柔比星主峰一维液相色谱图，二维液相色谱图及离子流色谱(TIC)图Fig. 1 The first dimensional HPLC-UV chromatogram, the dimensional HPLC-UV chromatogram and The TIC spectrums of epirubicin hydrochloride for injection

取样品溶液，按“1.2”项下实验条件及操作步骤测定，一维液相中未知杂质峰保留时间18.4min，切换到二维液相中后，紫外中主峰保留时间26.1min，总离子流中保留时间26.2min，质谱信号[M+H]+质荷比为1087.3539，未知杂质一维、二位液相及总离子流色谱图见图3。未知杂质二级质谱图见图4，碎片离子归属见表1，m/z570以下的碎片峰与表柔比星一致。Dinesh等[7]、闻宏亮等[8]和王颖等[9]均对不同来源的表柔比星二聚体进行过MS分析，其质谱图的差异提示表柔比星二聚体并非为单一结构。本研究中借助软件推测的分子式及表柔比星二级质谱图与未知杂质二级质谱图进行对比推测，确定此未知杂质为表柔比星二聚体，与EP 9.0中杂质G结构一致[10]。表柔比星二聚体具体结构见图5

图2 注射用盐酸表柔比星二级质谱图及二级碎片离子归属Fig. 2 The MS2 spectrum and the proposed structures of the epirubicin hydrochloride for injection

3 结论

图3 未知杂质一维液相色谱图，二维液相色谱图及质谱总离子流图Fig. 3 The first dimensional HPLC-UV chromatogram, the dimensional HPLC-UV chromatogram and the TIC spectrums of unknown impurity

图4 未知杂质二级质谱图Fig. 4 The MS2 spectrum of unknown impurity

图5 推测注射用盐酸表柔比星二聚体结构Fig. 5 The structure of dimer in epirubicin hydrochloride for injection

本研究采用在线二维液相色谱-质谱联用技术对注射用盐酸表柔比星的未知杂质进行分析，方法简便、灵敏，有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐及十二烷基硫酸钠缓冲盐色谱系统不适合用LC-MS快速鉴定杂质结构的难题。